Cryopreservation of rabbit semen: effectiveness of different permeable and non-permeable cryoprotectants on post-thaw sperm quality and reproductive performances

Attualmente, i sistemi di allevamento intensivi per la produzione di carne di coniglio si basano principalmente su programmi di inseminazione artificiale (IA). Pertanto, l’allevamento intensivo del coniglio da carne potrebbe usufruire di molti vantaggi se il seme potesse essere conservato dopo la raccolta e successivamente utilizzato per l’IA senza compromettere la fertilità. Due sono le tecnologie disponibili per la conservazione del seme di coniglio: la refrigerazione (in diluenti liquidi o solidi) e il congelamento. L'uso di seme congelato fornirebbe vantaggi più pratici per l'allevamento del coniglio da carne, in quanto, esso potrebbe potenzialmente mantenere la funzionalità delle cellule spermatiche per mesi o anni, facilitando il trasporto dei campioni nel tempo e nello spazio. La crioconservazione del seme è stata ampiamente utilizzata nel settore bovino, meno in altre specie animali, come i suini, ovini, polli e conigli. Pertanto, un gran numero di protocolli di congelamento per il seme di coniglio sono stati sviluppati da molti ricercatori. Diversi sono i fattori che possono influenzare il successo del congelamento del seme, quali la composizione del diluente di congelamento, la natura del crioprotettore (CPA) e la sua concentrazione, le condizioni di congelamento, e le temperature di raffreddamento e scongelamento. La scelta del CPA è sicuramente uno degli aspetti più importanti per ottenere un efficace protocollo di congelamento per il seme di coniglio. I CPA sono molecole, che vengono aggiunte nel diluente di congelamento, per ridurre gli stress fisici e chimici derivanti dal raffreddamento, congelamento e scongelamento degli spermatozoi. Infatti, il principale fattore biofisico che può causare la distruzione cellulare, durante il processo di crioconservazione, è la formazione dei cristalli di ghiaccio intracellulari. La loro formazione può essere evitata aumentando il processo di disidratazione cellulare, mediante l’aggiunta di un CPA nella soluzione di congelamento. Il CPA richiede un periodo di tempo necessario affinché esso penetri nello spermatozoo. Questo tempo è definito tempo di equilibratura, che varia in funzione della natura e della concentrazione del CPA. Quindi l'efficacia di un CPA dipende dalla natura chimica, dalla concentrazione e dal tempo ottimale con cui le cellule spermatiche si espongono ad esso prima del congelamento. Tuttavia, il paradosso è che i CPA permeabili potrebbero avere un effetto tossico sugli spermatozoi (causando la destabilizzazione della membrana e/o la denaturazione delle proteine e degli enzimi). Quest’effetto tossico dipende dalla concentrazione del CPA utilizzata e il tempo di esposizione delle cellule spermatiche con esso. Pertanto, per mitigare questi effetti tossici, è necessaria l'aggiunta di un CPA non-permeabile. Per la crioconservazione del seme di coniglio sebbene, siano stati studiati diversi CPA permeabili e non-permeabili, nessuno di essi ha riportato risultati soddisfacenti. Pertanto il congelamento del seme di coniglio è ancora carente di uno specifico ed efficace protocollo. In questa tesi sono state condotte tre ricerche, che hanno avuto come comune denominatore quello di trovare un protocollo di congelamento efficace per il seme di coniglio, studiando gli effetti di diversi CPA permeabili e non-permeabili. Il primo studio ha avuto come scopo quello di identificare un protocollo di congelamento adatto per il seme di coniglio confrontando gli effetti di diverse concentrazioni di due CPA permeabili (dimetilacetammide (DMA) e dimetilsolfossido (DMSO)) e diversi tempi di equilibratura sulla qualità post-scongelamento del seme. Dopo aver stabilito i migliori protocolli per ogni CPA, la loro efficacia è stata confrontata in vivo, esaminando la capacità fertilizzante del seme congelato con quello fresco. In questa ricerca sono stati utilizzati 32 maschi e 342 femmine. Il seme è stato raccolto mediante una vagina artificiale e costituiti pool di seme (4 eiaculati/pool). I pool sono stati diluiti nel rapporto 1:1 (v:v), con un diluente di congelamento composto da TCG (Tris-acido citrico-glucosio) contenente l’8, il 12 o il 16% di DMA o DMSO, rispettivamente (tutti contenenti il 2% di saccarosio come CPA non-permeabile), ottenendo una concentrazione finale del 4, 6 o 8% di DMA o DMSO, e l’1% di saccarosio. Il seme diluito è stato aspirato in straws da 0.25 mL. Le straws sono state equilibrate a 5°C per 5, 15 o 45 minuti prima di essere congelate sui vapori di azoto (a 5 cm dal livello di azoto). Le variabili valutate dopo lo scongelamento sono state: motilità, vitalità, resistenza osmotica, integrità acrosomiale e integrità del DNA. La concentrazione del CPA e il tempo di equilibratura hanno influenzato le variabili considerate. I migliori risultati sulla qualità post-scongelamento sono stati ottenuti utilizzando il 6% di DMA o l’8% di DMSO e un tempo di equilibratura di 45 minuti. Questi protocolli di congelamento sono stati selezionati per comparare i due CPA in una prova di inseminazione artificiale. Tre gruppi da 114 coniglie (28 nullipare e 86 pluripare in ciascun gruppo) sono state inseminate con seme fresco e seme congelato utilizzando i due migliori protocolli. Il tasso di concepimento e il numero di coniglietti nati sono stati simili tra il seme congelato con il DMSO (79.8% e 7.7±0.3) e il seme fresco (81.6% e 8.6±0.3) e sono stati significativamente più alti rispetto al seme congelato utilizzando la DMA (47.4% e 6.7±0.4). Inoltre, il numero di coniglietti nati vivi ottenuti da seme congelato con DMSO, pur essendo inferiore rispetto a quello registrato con il seme fresco, è stato più alto rispetto a quello ottenuto utilizzando la DMA (P<0.05). Lo stato fisiologico delle coniglie (nullipare o pluripare) non ha avuto alcuna influenza sui risultati di fertilità e di prolificità. I nostri risultati indicano che la sopravvivenza degli spermatozoi congelati di coniglio, con DMSO o DMA rispettivamente, è stata fortemente influenzata dalla concentrazione del CPA utilizzato e dal tempo di equilibratura. Secondo i nostri dati di fertilità e prolificità in vivo, emerge che il DMSO è più efficace rispetto alla DMA per la crioconservazione degli spermatozoi di coniglio. Il secondo studio ha avuto come obiettivo quello di identificare il CPA non-permeabile più efficace per il congelamento del seme di coniglio, comparando gli effetti di diverse concentrazioni di lipoproteine a bassa densità (LDL), del tuorlo d’uovo intero e del saccarosio sulla qualità post-scongelamento del seme. I CPA non-permeabili che sono risultati più efficaci nel preservare la qualità post-scongelamento in vitro sono stati successivamente valutati in vivo, determinando le performance riproduttive (tasso di concepimento, fertilità, numero di coniglietti nati e numero di coniglietti nati vivi) e comparandole con il seme fresco. In questo studio sono stati utilizzati 32 maschi e 90 femmine. I pool di seme sono stati diluiti con un rapporto di 1:1 (v:v) usando un diluente di congelamento composto da TCG, contenente il 16% di DMSO come CPA permeabile e il 6, 8, 10 o 15% di LDL estratte dal tuorlo d’uovo, 0.1 M di saccarosio o il 15% di tuorlo d’uovo come CPA non-permeabile. Il seme diluito è stato aspirato in straws da 0.25 mL e congelato sui vapori d’azoto. Dopo lo scongelamento sono state valutate le seguenti variabili: motilità, vitalità, resistenza-osmotica, integrità dell’acrosoma e del DNA. I risultati ottenuti in vitro hanno rivelato un effetto significativo della concentrazione di LDL sulla qualità post-scongelamento del seme. La concentrazione ottimale è stata quella del 10%, mostrando valori di motilità e integrità dell’acrosoma migliori rispetto a quelli del tuorlo d’uovo (P<0.05). Sulla base dei risultati ottenuti in vitro il 10% di LDL e il saccarosio sono stati scelti come i migliori CPA non-permeabili, e utilizzati per una prova in vivo. Tre gruppi da 30 coniglie sono stati inseminati con seme fresco o con seme congelato utilizzando il saccarosio e il 10% di LDL, rispettivamente. Il tasso di concepimento ottenuto con il seme congelato con il saccarosio (86.7%) è stato significativamente più alto (P<0.05) rispetto a quello del seme congelato con le LDL (66.7%). Le performance riproduttive ottenute con il saccarosio sono state simili a quelle ottenute con il seme fresco. I nostri risultati indicano che, marcatamente in vivo, il saccarosio è il miglior CPA non-permeabile per il congelamento del seme di coniglio. Lo scopo del terzo studio è stato quello di valutare l’effetto dell’aggiunta del Ficoll 70, nel diluente di congelamento che conteneva saccarosio e DMSO, sulla qualità del seme di coniglio post-scongelamento. Il Ficoll, polimero di elevato peso molecolare, aumenta la viscosità del mezzo e per questo potrebbe proteggere meglio gli spermatozoi durante il processo di congelamento. Per questa sperimentazione sono stati utilizzati 4 maschi e 86 femmine. Sono stati utilizzati solo quegli eiaculati che hanno mostrato una buona motilità iniziale (>80%). I pool di seme sono stati diluiti con i seguenti medium di congelamento: 1) diluente commerciale (DMRS; Minitube, Germany) contenente il 16% di DMSO e il 2% di saccarosio (controllo), 2) Minitube contenente il 16% di DMSO, il 2% di saccarosio e il 4% di Ficoll 70 (Ficoll). Il seme diluito è stato aspirato in straws da 0.25 mL e congelato sui vapori di azoto liquido. La qualità del seme fresco e scongelato è stata valutata in vitro usando il Computer Assisted Semen Analysis system (CASA), sonde fluorescenti (peanut agglutinin (PNA)-Alexa Fluor®; annexin V-FLOUS) e mediante microscopia elettronica. Un migliore effetto crioprotettivo è stato osservato dopo l’aggiunta del Ficoll 70 rispetto al seme congelato con il solo saccarosio e DMSO. I maggiori valori (P<0.05) di motilità totale e progressiva degli spermatozoi subito dopo lo scongelamento e 30 minuti di incubazione a 37°C sono ottenuti nel seme congelato con il Ficoll. Inoltre, il numero maggiore (P<0.05) di spermatozoi con acrosoma integro sono stati ritrovati nel gruppo trattato con il Ficoll rispetto al controllo. Nessuna differenza significativa è stata osservata per il tasso di fertilità e numero di nati tra il seme congelato e il seme fresco. Questo studio ha dimostrato che l’aggiunta del Ficoll 70 potrebbe migliorare la qualità del seme di coniglio post-scongelamento. Queste ricerche sono state importanti, in quanto siamo stati in grado di trovare protocolli di crioconservazione efficaci, che hanno mostrato performance riproduttive simili a quelle del seme fresco. Queste scoperte forniscono un contributo fondamentale per l’utilizzo di dosi di seme congelato da destinare all’IA negli allevamenti intensivi del coniglio da carne. Inoltre, l’utilizzo del seme congelato potrebbe essere di grande importanza per la creazione di una banca genetica per razze di coniglio nazionali o in via d’estinzione.