Analysis of autophagy role in glioblastoma biology

Autophagy is one of the main intracellular degradation systems, through which long-lived protein and other cytoplasmic compounds are included in double-membrane vesicles, named autophagosomes, that fuse with lysosomes to be degraded. Several literature data demonstrate the involvement of autophagy in tumorigenesis, highlighting its dual role depending on tumor stage and on specific microenvironmental conditions. Despite advances in tumor treatments, glioblastoma (GBM) is a still incurable cancer and the relation with autophagy is controversial. In this regard, this doctoral thesis was aimed at analyse the role of autophagy in GBM physiopathology. We started from the evidence that autophagy induces mesenchymal to epithelial transition-like in GBM cells through down-regulation of SNAI factors, resulting in cadherin up-regulation. Based on these observations, we found an impairment of Wnt/β-catenin signalling upon autophagy induction in GBM cells. Unlike other types of systems, we also observed a significant re-localization of β-catenin in sub-membranes areas, associating with N-cadherin. We subsequently investigated the expression of EGFR and EGFR-mediated signalling pathways in GBM cells upon autophagy and mTOR pathway inhibition. EGFR is frequently overexpressed in GBM, enhancing an aberrant cell proliferation. We observed that mTOR inhibition results in the EGFR internalization within the cell, delivering the receptor to lysosomes for degradation. As a consequence, an impairment of MAPK/ERK pathway, one of the main signalling pathways involved in cell proliferation, occurred. Finally, we found Src as a key player in EGFR trafficking. In fact, an increase of Src activation, that is commonly required for EGFR phosphorylation, occurs upon mTOR inhibition and is responsible for EGFR internalization. Taking together, the results collected in this thesis showed that forcing GBM cells to undergo autophagy leads to an impairment of intracellular signalling pathways typically hyperactivated in GBM and induces cells to acquire epithelial-like phenotype. Thus, we support the idea that autophagy/mTOR inhibition could be employed to contrast GBM tumorigenesis.

L’autofagia è uno dei principali sistemi di degradazione intracellulari, attraverso cui proteine invecchiate ed altri componenti citoplasmatici vengono racchiusi in vescicole a doppia membrana, chiamate autofagosomi, che vanno poi a fondersi con i lisosomi per essere degradate. Dati di letteratura dimostrano il coinvolgimento dell’autofagia nella cancerogenesi, sottolineando come essa svolga un duplice ruolo in base allo stadio tumorale e alle specifiche condizioni del microambiente tumorale. Nonostante gli attuali progressi nel trattamento del cancro, il Glioblastoma (GBM) è ritenuto ancora oggi un tumore incurabile e la sua relazione con l’autofagia rimane controversa. A tal proposito, questa tesi di dottorato è volta ad analizzare il ruolo dell’autofagia nella fisiopatologia del GBM. Siamo partiti dall’evidenza che l’autofagia induce la transizione mesenchima-epiteliale in cellule di GBM attraverso la down-regolazione dei fattori SNAI che, a sua volta, risulta nell’ up-regolazione delle caderine di membrana. Basandoci su questi risultati, abbiamo investigato la via del segnale Wnt/β-catenina, osservando che tale via risulta alterata in seguito ad induzione di autofagia nelle cellule di GBM. A differenza di altri tipi di sistema, abbiamo inoltre osservato una significativa ri-localizzazione della β-catenina al di sotto della membrana plasmatica, in associazione con la N-caderina. Successivamente, abbiamo analizzato l’espressione di EGFR e la via del segnale mediate da questo recettore nelle cellule di GBM in seguito a induzione autofagica ed inibizione della via di mTOR. EGFR, infatti, risulta spesso over-espresso nel GBM, portando ad un aumento incontrollato della proliferazione cellulare. A tal proposito, abbiamo osservato che l’inibizione di mTOR stimola l’internalizzazione di EGFR nella cellula e la sua degradazione a livello lisosomiale. Come conseguenza, si verifica una alterazione della via di MAPK/ERK, una delle principali vie del segnale implicate nella proliferazione cellulare. Abbiamo osservato, inoltre, che la proteina Src sembra svolgere un ruolo chiave nel traffico intracellulare di EGFR. In seguito ad inibizione di mTOR, infatti, si verifica un aumento dell’attivazione di Src, normalmente richiesta per la fosforilazione di EGFR, risultando quindi responsabile dell’internalizzazione di EGFR. I risultati riportati in questa tesi mostrano che l’induzione autofagica nelle cellule di GBM porta ad un’alterazione di vie del segnale intracellulari tipicamente iper-attivate nel GBM ed induce le cellule ad acquisire un fenotipo simil-epiteliale. Supportiamo quindi l’idea che l’autofagia/inibizione di mTOR possa essere un valido strumento nella lotta contro il GBM.