Biological control against Penicillium expansum: influence of Papiliotrema terrestris LS28 on extracellular pH and patulin biosynthesis, and development of molecular-genetics tools for the validation of biocontrol mechanisms

Synthetic fungicides are the primary means to control postharvest diseases of fruits. However, the growing concern for human health, environmental pollution and the onset of fungicide-resistant fungal strains call for safer control methods. Microbe-based biocontrol recently emerged as a promising alternative to chemicals. The study of the mechanisms of action of microbial biocontrol agents is pivotal to improve their performances and to foster their practical utilization. In this work, we focused on the mechanisms of the biocontrol agent (BCA) Papiliotrema terrestris LS28. This basidiomycete yeast effectively outcompetes Penicillium expansum on stored apples. This fungal pathogen causes blue mould disease on stored pome fruits, and produces patulin, thus leading to the contamination of fruits and derived products with this mycotoxin. I examined the influence of the BCA on P. expansum-driven acidification, which had previously been proven to be a key strategy of the fungal virulence, and on patulin (PAT) production. For this purpose, we have better characterized P. expansum analyzing the pH dynamics during its growth and how this parameter can influence the PAT production. In non-buffered media, P. expansum led to a quick extracellular acidification to pH<3 after only z24 h. Conversely, the acidification was delayed to 120 h when the pathogen was co-cultured with the BCA. When P. expansum was grown in buffered media at pH values >3 to <7, PAT production (µg/g dried mycelium) was the highest at pH=5, while only traces were detected at pH=3, and significantly lower concentration at pH=7.An analogous pattern was observed in dual culture in an apple tissue-mimicking substrate. LS28 counteracted the pathogen-driven pH decrease by maintaining pH at a value slightly higher than 4.5, i.e. within the pH range at which the peak of PAT biosynthesis was recorded. In biocontrol assays, a BCA concentration of 5x106 CFU/ml lowered disease incidence and severity as well as the overall PAT contamination (µg PAT/g of decayed apple tissue) of infected fruits caused by P. expansum. However, it led to an increase of the specific rate of PAT biosynthesis in the apple tissue (µg PAT/cm of lesion diameter). In the same experiments, the addition of an alkalinizing compound improves the biocontrol activity by LS28 resulting in lower disease severity and disease incidence but further increases the specific rate of PAT biosynthesis. Conversely, the amendment with an acidifying compound had opposite effects, i.e. higher disease incidence and severity but lower specific mycotoxigenic activity. Taken together, our results suggest that pH modulation by LS28 is a new biocontrol mechanism that counteracts the acidification and, as a consequence, the virulence of P. expansum. On the other hand, the BCA-based delay of acidification causes an increase of the specific rate of patulin biosynthesis by the fungal pathogen, by prolonging the time interval at which pH value is within the optimal range for PAT biosynthesis. In order to validate new (e.g. pH modulation) and/or previously reported mechanisms of biocontrol (competition for space and nutrients, resistance to oxidative stress etc.), and to identify the genes putatively involved in these mechanisms, we developed molecular genetics tools for P. terrestris LS28. Constructs for random insertional mutagenesis and for targeted mutagenesis were generated by cloning the marker genes NEO and HYG (conferring resistance to Neomycin and Hygromycin B, respectively) under the control of histone H3 gene promoter and terminator of P. terrestris LS28. The BCA was transformed through biolistic, electroporation and Agrobacterium-mediated transformation. Resistant colonies were selected from all the transformation systems. 672 random insertional mutants were tested for their sensibility to stressors related to biocontrol activity. Seventeen phenotypes of interest, i.e. with higher sensitivity to these stressors than the wild type strain LS28, were identified, and are currently under characterization. For the development of a targeted mutagenesis system, deletion cassettes harbouring the HYG marker were designed for the genes YAP1 and RIM101, two transcription factors that are involved in the response to oxidative stress and to alkaline pH, respectively. Deletion mutants yap1Δ and rim101Δ were obtained. Complementation cassettes were also designed and complemented strains [yap1Δ::yap1(NEOR) and rim101Δ::rim101(NEOR)] were obtained. The deletion mutants yap1Δ and rim101Δ and the respective complemented strains were first in vitro phenotypically characterized in tests with different stress compounds and then tested in vivo in biological control assays. During these experiments a significant reduction in the biocontrol activity for the yap1Δ mutant was found while the rim101Δ in vivo characterization is still in progress.

I fungicidi sintetici rappresentano il mezzo principale per il controllo delle malattie post-raccolta dei frutti. Tuttavia, la crescente preoccupazione per la salute umana, l'inquinamento ambientale e l'insorgenza di resistenze ai fungicidi nei ceppi fungini richiedono metodi di contenimento più sicuri. Per questo motivo la lotta biologica (o biocontrollo) basata su agenti microbici è emersa negli ultimi anni come un'alternativa promettente all’utilizzo di sostanze chimiche. Lo studio dei meccanismi di azione degli agenti di biocontrollo microbico è fondamentale per il miglioramento delle loro prestazioni al fine di promuoverne l’utilizzo. In questo lavoro, ci siamo concentrati sui meccanismi di azione dell'agente di biocontrollo (BCA) Papiliotrema terrestris LS28. Questo lievito basidiomicete contiene efficacemente lo sviluppo del fungo fitopatogeno Penicillium expansum, agente causale del marciume verde-azzurro delle pomacee durante la fase di post-raccolta. Penicillium expansum induce una forte acidificazione dei tessuti vegetali come parte del suo processo infettivo e sintetizza la micotossina patulina (PAT), causando quindi la contaminazione dei frutti e dei prodotti derivati. Abbiamo esaminato l'influenza del BCA sull’alterazione del pH prodotta da P. expansum durante l’attacco dei tessuti vegetali. A tale scopo abbiamo meglio caratterizzato P. expansum, analizzando le dinamiche di pH durante la sua crescita e come questo parametro potesse influenzare la produzione di PAT (micotossina/fattore di aggressività). In terreno non tamponato, P. expansum induce una rapida acidificazione fino a pH<3 dopo 24 ore. Per contro, quando il patogeno è in co-coltura col BCA, l'acidificazione subisce un rallentamento significativo e il pH raggiunge gli stessi valori del patogeno in coltura pura (pH<3) soltanto dopo circa 120 ore. Allevando P. expansum in terreni tamponati a 3<7, la produzione di PAT (μg/g di micelio essiccato) ha un picco a pH=5, mentre ne sono state rilevate solo tracce a pH=3 e valori significativamente più bassi a pH= 7. Un andamento analogo è stato osservato nella coltura duale in substrato liquido a base di brodo di mela. Il BCA LS28 rallenta la rapida acidificazione causata dal patogeno mantenendo il pH a circa 4-5, corrispondente al pH a cui è rilevato il picco di biosintesi di PAT. In saggi di biocontrollo su frutti di mela (condizione in vivo), la concentrazione di BCA di 5x106 CFU/ml riduce l'incidenza della malattia e la contaminazione complessiva da PAT (μg PAT/g di tessuto di mela marcescente), ma produce un aumento dell’attività micotossigenica specifica (μg PAT/cm di diametro della lesione). Negli stessi esperimenti, l'aggiunta di un composto alcalinizzante in combinazione con il BCA, induce un aumento dell'attività di biocontrollo causando una minore incidenza della malattia e un ulteriore aumento del tasso specifico di biosintesi di PAT. Invece, l’aggiunta di un composto acidificante determina un andamento opposto, cioè maggiore incidenza della malattia e minore attività micotossigenica specifica. Nel complesso, i risultati ottenuti suggeriscono che la modulazione del pH da parte di LS28 possa essere un nuovo meccanismo di biocontrollo basato sul contrasto, operato dal BCA, all'acidificazione indotta dal patogeno e necessaria per l’attacco enzimatico dei tessuti vegetali, interferendo così con la virulenza di P. expansum. Per contro, l’effetto del BCA sul pH causa un aumento del tasso specifico di biosintesi della PAT da parte di P. expansum, prolungando il tempo in cui il pH è prossimo ai valori ottimali per la biosintesi della micotossina. Al fine di validare meccanismi di biocontrollo nuovi (per es. modulazione del pH) e/o precedentemente identificati (competizione per spazio e nutrienti, resistenza allo stress ossidativo) e per identificare i geni coinvolti in tali meccanismi, sono stati sviluppati strumenti di genetica molecolare per P. terrestris LS28. Sono stati generati costrutti per random insertional mutagenesis e per targeted mutagenesis clonando i geni marcatori NEO e HYG (che conferiscono resistenza rispettivamente a Neomicina G418 e Igromicina B) sotto il controllo di promotore e terminatore del gene dell'istone H3 di P. terrestris LS28. Il BCA è stato trasformato mediante biolistica, elettroporazione e trasformazione mediata da Agrobacterium. Dopo test di stabilità sono state selezionate colonie resistenti da tutti i sistemi di trasformazione. I 672 mutanti inserzionali random sono stati testati per la sensibilità a diversi fattori di stress correlati all'attività di biocontrollo. Di questi, 17 ceppi hanno mostrato fenotipi di interesse, cioè maggiore sensibilità ai fattori di stress esaminati, e sono attualmente in fase di caratterizzazione. Per lo sviluppo di un sistema di mutagenesi mirata, sono state disegnate cassette di delezione, basate sul marcatore HYG, per i geni YAP1 e RIM101, due fattori di trascrizione coinvolti rispettivamente nella risposta allo stress ossidativo e al pH alcalino. Sono stati ottenuti mutanti di delezione yap1Δ e rim101Δ. Sono state anche generate cassette di complementazione contenenti il marcatore NEO, e ceppi complementanti [yap1Δ::yap1 (NEOR) e rim101Δ::rim101 (NEOR)] sono stati ottenuti mediante elettroporazione. Per i ceppi mutanti e i rispettivi complementanti è stata eseguita una prima caratterizzazione in vitro per diversi stress e successivamente è stata verificata la capacità di controllare P. expansum in vivo, comparando l’attività di biocontrollo con quella del ceppo wild type. Nel corso di questi esperimenti è stata riscontrata una sensibile riduzione della capacità di biocontrollo per il mutante yap1Δ mentre il mutante rim101Δ è ancora in fase di caratterizzazione in vivo.