The present study has been organized into three main experiments aimed to explore the bioremediation potential of Populus alba in experimental system and in plant-rhizosphere fungi associations. In the first part, it was investigated accumulation, translocation and tolerance of autotrophic Populus alba clone “Villafranca” in the response to excess concentrations of cadmium (Cd) and copper (Cu) provided to the plants. For this purpose, increasing concentrations of Cd (0, 5, 50 and 250 μM) and Cu (0, 5, 50, 250 and 500 μM) were administered to the growth medium. Filter bags, instead of the conventional in vitro screening, were applied to improve the experimental design. Results showed that metals treatment after 15 days induced Cd and Cu enhancement in shoots and roots at increasing metal concentration in the medium. The highest Cd content was found in leaves, while the highest Cu content was found in roots. In “Villafranca”, Cu showed toxic effects on the development of the seedlings, especially at the highest concentrations, reducing plant dry mass. However, the tolerance index (Ti) indicated good tolerance in this clone under exposure to excess metal concentrations, whereas plants had higher translocation factor (Tf). Therefore, on the findings basis, it is recommend in vitro selection of tolerant genotypes, aimed at providing early indication on accumulation potentiality and tolerance capability in research on plant sensitivity to excess heavy metal concentrations. The second part of the research activity has included in vitro assessments aimed to investigate the mechanisms of Cd uptake-boosting by several Trichoderma species. Fifty-two Trichoderma strains were initially screened for their tolerance to a range of Cd concentrations (0, 5, 50, 250 µM). Based on fungal growth rate under metal stress, twenty-seven cadmium tolerant strains belonging to 6 different Trichoderma species (namely T. atroviride, T. citrinoviride, T. koningii, T. hamatum, T. harzianum, and T. polysporum) were selected. Based on the investigations, the mechanism of Cd-tolerance on the Trichoderma strains, was attributed at least two different tolerance strategies: ì) exclusion of the toxicant and, ii) metal intracellular compartmentalization and/or enzymatic detoxification. Strains that used this latter strategy may find a possible application as bioaccumulators intended for bioremediation of wastewater. Nevertheless, the behavior of these strains also need to be studied at the rhizosphere level, with regard to a possible translocation of the uptaken Cd at the interface of the plant-Trichoderma symbiosis. Finally, the study was focused on the phytoremediation of cadmium-contaminated soils by means of the tree species Populus alba L., clone “Querce”, in association with two Cd-tolerant strains of Trichoderma spp., rhizosphere fungi. The effect of high Cd concentration (250 µM) was evaluated on plant growth and Cd uptake of poplar plantlets inoculated and non-inoculated with strains T1 and T2 in pot assays. Cd uptake was determined in root, leaf and stem tissues. In order to gain insights into the poplar physiological response in the interaction with the beneficial microorganisms, the spectrum of emitted volatile compounds (VOCs) of plant inoculated with Trichoderma strains was determined. Our results indicate that T2 treatment exhibited the highest metal tolerance and Cd translocation in stems compared with the other treatments. In these experimental conditions, T2 showed interesting trait in the enhancement of Cd translocation by roots to stems of poplar plants. Regarding VOC analyses, carried out on the 81 identificated VOCs, data indicated that, the two Trichoderma strains inoculation and Cd administration induced significant variation in the VOCs emitted by stressed plants, compared to control plants. However, no correlation was found between VOCs emitted and the strengthening tolerance mediated by the strains. Therefore, further investigations are required to understand the mechanisms induced by the two bio-inoculant agents and involved in “Querce” clone tolerance under metal stress.

Il presente studio è stato organizzato in tre prove, volte a valutare il potenziale di biorimedio del Populus alba, in differenti condizioni sperimentali ed in associazione con funghi della rizosfera. Nella prima parte della ricerca è stata studiata la capacità di accumulo, traslocazione e tolleranza del clone "Villafranca" di Populus alba esposto a concentrazioni crescenti di cadmio (Cd 0, 5, 50 e 250 μM) e rame (Cu 0, 5, 50, 250 e 500 μM) in condizioni di autonomia autotrofica. L’induzione dell’autotrofia è stata garantita mediante l’applicazione di filtri che hanno consentito il miglioramento dello screening in vitro. I risultati hanno mostrato, dopo 15 giorni, un aumento di Cd e Cu nella parte aerea e nelle radici, all'aumentare della concentrazione dei metalli nel substrato. In "Villafranca", il Cu ha evidenziato effetti tossici sullo sviluppo delle piantine, soprattutto ad alte concentrazioni, causando una riduzione della biomassa secca. L'indice di tolleranza (Ti) e il fattore di traslocazione (TF) denotavano una buona tolleranza e capacità di traslocazione del metallo in questo clone, quando esposto ad elevate concentrazioni. Alla luce dei risultati ottenuti, si raccomanda l’utilizzo di questo sistema di sceening condotto in vitro, come valido strumento volto a selezionare genotipi di specie vegetali resistenti ad elevate concentrazioni di metalli pesanti; permettendo di fornire rapidamente indicazioni circa le potenzialità di accumulo e di tolleranza. La seconda parte dello studio ha incluso valutazioni in vitro atte ad indagare i meccanismi coinvolti nell’aumento dell'assorbimento di Cd da parte di diverse specie di funghi del genere Trichoderma. A tale scopo, è stata inizialmente testata la capacità di tolleranza di 52 ceppi di Trichoderma nei confronti di diverse concentrazioni di Cd (0, 5, 50, 250 μM). Dai risultati ottenuti è stato possibile effettuare la selezione di 27 ceppi tolleranti il metallo appartenenti a 6 specie di Trichoderma (T. atroviride, T. citrinoviride, T. koningii, T. hamatum, T. harzianum e T. polysporum). Sulla base delle indagini effettuate, il meccanismo di tolleranza messo in atto dai 27 Trichoderma è stato attribuito ad almeno due diverse strategie: ì) esclusione del contaminante e, ii) compartimentalizzazione intracellulare del metallo e/o detossificazione enzimatica. I ceppi che hanno mostrato quest'ultima strategia potrebbero essere vantaggiosamente sfruttati nei processi di biorisanamento del suolo. A tal proposito, la terza parte dello studio si è concentrata sul possibile utilizzo di due ceppi di Trichoderma, tolleranti il Cd, in associazione con il clone di pioppo "Querce" nelle strategia di bonifica di terreni fortemente contaminati dal metallo. Quest’ultima parte ha inteso valutare l’effetto dell'elevata concentrazione di Cd (250 μM) sulla crescita, l’'assorbimento e la traslocazione del metallo in piante di pioppo allevate in vaso, inoculate e non inoculate con i ceppi T1 e T2. Inoltre, è stato determinato lo spettro dei composti volatili (VOC) emessi dalle piante inoculate con i due ceppi di Trichoderma al fine di ottenere informazioni sulla risposta fisiologica del clone dovuta all’interazione con i due microrganismi. I risultati indicavano che il trattamento con T2 induceva una maggior tolleranza al metallo in questo clone ed incrementava la traslocazione del Cd dalle radici verso le il fusto, se paragonato con il trattamento T1 ed il controllo. In queste condizioni sperimentali, il ceppo T2 presentava delle caratteristiche interessanti riguardo il potenziamento della translocazione di Cd dalle radici al fusto nel clone “Querce”. L’analisi gas-cromatografica ha permesso l’individuazione di 81 VOC. L’esaminazione di tali VOC emessi indicava che, l'inoculazione dei due ceppi di Trichoderma e la somministrazione di Cd inducevano una variazione significativa dei VOC emessi dalle piante stressate, rispetto alle piante di controllo. La produzione di queste sostanze, tuttavia, sembrava non essere coinvolta nell’aumento della tolleranza mediata dai ceppi T2 e T1 nelle piante di pioppo esposte al Cd; Alla luce di tali risultati, restano ancora da accertarsi le significative variazioni osservate nell'emissione di VOC, in piante trattate con i due bio-inoculanti e cresciute in presenza o in assenza di Cd.

Exploring the Bioremediation potential of Populus alba in experimental system and in plant-rhizosphere fungi associations

MARZILLI, MORENA
2019-06-10

Abstract

The present study has been organized into three main experiments aimed to explore the bioremediation potential of Populus alba in experimental system and in plant-rhizosphere fungi associations. In the first part, it was investigated accumulation, translocation and tolerance of autotrophic Populus alba clone “Villafranca” in the response to excess concentrations of cadmium (Cd) and copper (Cu) provided to the plants. For this purpose, increasing concentrations of Cd (0, 5, 50 and 250 μM) and Cu (0, 5, 50, 250 and 500 μM) were administered to the growth medium. Filter bags, instead of the conventional in vitro screening, were applied to improve the experimental design. Results showed that metals treatment after 15 days induced Cd and Cu enhancement in shoots and roots at increasing metal concentration in the medium. The highest Cd content was found in leaves, while the highest Cu content was found in roots. In “Villafranca”, Cu showed toxic effects on the development of the seedlings, especially at the highest concentrations, reducing plant dry mass. However, the tolerance index (Ti) indicated good tolerance in this clone under exposure to excess metal concentrations, whereas plants had higher translocation factor (Tf). Therefore, on the findings basis, it is recommend in vitro selection of tolerant genotypes, aimed at providing early indication on accumulation potentiality and tolerance capability in research on plant sensitivity to excess heavy metal concentrations. The second part of the research activity has included in vitro assessments aimed to investigate the mechanisms of Cd uptake-boosting by several Trichoderma species. Fifty-two Trichoderma strains were initially screened for their tolerance to a range of Cd concentrations (0, 5, 50, 250 µM). Based on fungal growth rate under metal stress, twenty-seven cadmium tolerant strains belonging to 6 different Trichoderma species (namely T. atroviride, T. citrinoviride, T. koningii, T. hamatum, T. harzianum, and T. polysporum) were selected. Based on the investigations, the mechanism of Cd-tolerance on the Trichoderma strains, was attributed at least two different tolerance strategies: ì) exclusion of the toxicant and, ii) metal intracellular compartmentalization and/or enzymatic detoxification. Strains that used this latter strategy may find a possible application as bioaccumulators intended for bioremediation of wastewater. Nevertheless, the behavior of these strains also need to be studied at the rhizosphere level, with regard to a possible translocation of the uptaken Cd at the interface of the plant-Trichoderma symbiosis. Finally, the study was focused on the phytoremediation of cadmium-contaminated soils by means of the tree species Populus alba L., clone “Querce”, in association with two Cd-tolerant strains of Trichoderma spp., rhizosphere fungi. The effect of high Cd concentration (250 µM) was evaluated on plant growth and Cd uptake of poplar plantlets inoculated and non-inoculated with strains T1 and T2 in pot assays. Cd uptake was determined in root, leaf and stem tissues. In order to gain insights into the poplar physiological response in the interaction with the beneficial microorganisms, the spectrum of emitted volatile compounds (VOCs) of plant inoculated with Trichoderma strains was determined. Our results indicate that T2 treatment exhibited the highest metal tolerance and Cd translocation in stems compared with the other treatments. In these experimental conditions, T2 showed interesting trait in the enhancement of Cd translocation by roots to stems of poplar plants. Regarding VOC analyses, carried out on the 81 identificated VOCs, data indicated that, the two Trichoderma strains inoculation and Cd administration induced significant variation in the VOCs emitted by stressed plants, compared to control plants. However, no correlation was found between VOCs emitted and the strengthening tolerance mediated by the strains. Therefore, further investigations are required to understand the mechanisms induced by the two bio-inoculant agents and involved in “Querce” clone tolerance under metal stress.
10-giu-2019
Il presente studio è stato organizzato in tre prove, volte a valutare il potenziale di biorimedio del Populus alba, in differenti condizioni sperimentali ed in associazione con funghi della rizosfera. Nella prima parte della ricerca è stata studiata la capacità di accumulo, traslocazione e tolleranza del clone "Villafranca" di Populus alba esposto a concentrazioni crescenti di cadmio (Cd 0, 5, 50 e 250 μM) e rame (Cu 0, 5, 50, 250 e 500 μM) in condizioni di autonomia autotrofica. L’induzione dell’autotrofia è stata garantita mediante l’applicazione di filtri che hanno consentito il miglioramento dello screening in vitro. I risultati hanno mostrato, dopo 15 giorni, un aumento di Cd e Cu nella parte aerea e nelle radici, all'aumentare della concentrazione dei metalli nel substrato. In "Villafranca", il Cu ha evidenziato effetti tossici sullo sviluppo delle piantine, soprattutto ad alte concentrazioni, causando una riduzione della biomassa secca. L'indice di tolleranza (Ti) e il fattore di traslocazione (TF) denotavano una buona tolleranza e capacità di traslocazione del metallo in questo clone, quando esposto ad elevate concentrazioni. Alla luce dei risultati ottenuti, si raccomanda l’utilizzo di questo sistema di sceening condotto in vitro, come valido strumento volto a selezionare genotipi di specie vegetali resistenti ad elevate concentrazioni di metalli pesanti; permettendo di fornire rapidamente indicazioni circa le potenzialità di accumulo e di tolleranza. La seconda parte dello studio ha incluso valutazioni in vitro atte ad indagare i meccanismi coinvolti nell’aumento dell'assorbimento di Cd da parte di diverse specie di funghi del genere Trichoderma. A tale scopo, è stata inizialmente testata la capacità di tolleranza di 52 ceppi di Trichoderma nei confronti di diverse concentrazioni di Cd (0, 5, 50, 250 μM). Dai risultati ottenuti è stato possibile effettuare la selezione di 27 ceppi tolleranti il metallo appartenenti a 6 specie di Trichoderma (T. atroviride, T. citrinoviride, T. koningii, T. hamatum, T. harzianum e T. polysporum). Sulla base delle indagini effettuate, il meccanismo di tolleranza messo in atto dai 27 Trichoderma è stato attribuito ad almeno due diverse strategie: ì) esclusione del contaminante e, ii) compartimentalizzazione intracellulare del metallo e/o detossificazione enzimatica. I ceppi che hanno mostrato quest'ultima strategia potrebbero essere vantaggiosamente sfruttati nei processi di biorisanamento del suolo. A tal proposito, la terza parte dello studio si è concentrata sul possibile utilizzo di due ceppi di Trichoderma, tolleranti il Cd, in associazione con il clone di pioppo "Querce" nelle strategia di bonifica di terreni fortemente contaminati dal metallo. Quest’ultima parte ha inteso valutare l’effetto dell'elevata concentrazione di Cd (250 μM) sulla crescita, l’'assorbimento e la traslocazione del metallo in piante di pioppo allevate in vaso, inoculate e non inoculate con i ceppi T1 e T2. Inoltre, è stato determinato lo spettro dei composti volatili (VOC) emessi dalle piante inoculate con i due ceppi di Trichoderma al fine di ottenere informazioni sulla risposta fisiologica del clone dovuta all’interazione con i due microrganismi. I risultati indicavano che il trattamento con T2 induceva una maggior tolleranza al metallo in questo clone ed incrementava la traslocazione del Cd dalle radici verso le il fusto, se paragonato con il trattamento T1 ed il controllo. In queste condizioni sperimentali, il ceppo T2 presentava delle caratteristiche interessanti riguardo il potenziamento della translocazione di Cd dalle radici al fusto nel clone “Querce”. L’analisi gas-cromatografica ha permesso l’individuazione di 81 VOC. L’esaminazione di tali VOC emessi indicava che, l'inoculazione dei due ceppi di Trichoderma e la somministrazione di Cd inducevano una variazione significativa dei VOC emessi dalle piante stressate, rispetto alle piante di controllo. La produzione di queste sostanze, tuttavia, sembrava non essere coinvolta nell’aumento della tolleranza mediata dai ceppi T2 e T1 nelle piante di pioppo esposte al Cd; Alla luce di tali risultati, restano ancora da accertarsi le significative variazioni osservate nell'emissione di VOC, in piante trattate con i due bio-inoculanti e cresciute in presenza o in assenza di Cd.
Bioremediation; Heavy metals; Trichoderma; Populus alba
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