Characterisation of different hop ecotypes (Humulus lupulus, L.) in Central Italy and evaluation of the biological activity of their extracts, EO and components against Sitophilus granarius (L.)

The indiscriminate use of synthetic insecticides for several decades has raised long-term human health and environmental concerns, mainly due to their slow degradation in the environment and toxic residues in the products, as well as the evolution of resistance to pesticides in pest populations (Isman, 2006). The serious problems of insecticide resistance in pests and the contamination of the biosphere associated with large scale use of synthetic pesticides have led to the search for eco-friendly pesticides with greater selectivity to the pests. This awareness has created a worldwide interest in the development of alternative strategies, including the discovery of newer insecticides that are more environmentally friendly than synthetic chemicals (Rajashekar et al., 2012a, b; Miresmailli and Isman 2014). In this context, the use of insecticides based on botanical extracts is attracting considerable interest among both researchers and consumers. It’s known that various plant compounds bind to some biological macromolecules (mainly proteins), interacting with specific sites inside the cells. Lately, the study on the interactions among natural substances and cellular components has assumed an important role in the development of synthetic medicines/drugs/compounds. This could encourage the identification of new plant compounds/extracts with biological activity since they constitute the basis for new biotechnological approaches to plant defense and its management. Therefore, in addition to new classes of insecticides, chemicals that have different modes of action are needed to maintain stable food production (Gokce et al., 2012). Most plants defend themselves from herbivory through production of secondary compounds such as terpenes, phenolics and nitrogen-containing compounds (Taiz and Zeiger, 2010). Some of these secondary compounds, including pyrethrin and rotenone, produce direct toxicity, while others cause either physiological disruption as caused by growth regulators or behavioral effects as repellents, attractants or antifeedants (Isman, 1999; Gokce et al., 2006). Hop (Humulus lupulus L.) is a high-climbing, perennial vine, utilized in the brewing industry to add flavor and bitterness to beer (Chadwick et al., 2006) whose production has been estimated at over 100.000 tons worldwide (FAOSTAT, 2014). However, aerial parts of this plant produces several secondary metabolites as bitter resins, essential oil (EO), tannins and terpenes, proved to have biological activities: xanthohumol was reported to show anticancer and antioxidant effects (Colgate et al., 2010); hop iso-α-acids positively affect glucose metabolism, diet-induced obesity and its relative cognitive decline in rodents (Miura et al., 2005; Yajima et al., 2005; Ayabe et al. 2018); main compounds of EO such as α-humulene, α-myrcene and β-caryophyllene showed antimicrobial activities against different strains of Gram-positive and Gram-negative bacteria (Stompor and Zarowska 2016). Moreover, besides medical purposes (Bocquet et al., 2018a), the interest in hop extracts/compounds is increasing in the light of a their possible use also in pest control (Bocquet et al., 2018b). In particular, several papers highlighted activities against insect due to both antifeedant and repellent activities for hop extracts or EO compounds of this plant (DeGrandi et al 2012; Powell et al 1997). Aim of the present study is to gain a further insight into wild hop properties. Thus, in a first part the biological activity of …hop extracts, EO and its principal chemical compounds (α-humulene, α-myrcene and β-caryophyllene) against the granary weevil Sitophilus granarius (L.) (Coleoptera Dryophthoridae) was investigated;subsequently, the attention was focused on the characterization of hop ecotypes in different locations of Central Italy (Abruzzo, Molise) in order to identify the best one in terms of polyphenols content associated with a high antioxidant power . The terpenes, α-humulene, β-myrcene and β-caryophyllene were the main components (77.6%) of EO. Among all chemical compounds and extracts tested, EO was able to exert the highest contact toxicity with LD50 and LD90 values of 13.30 and 40.23 µg/adult after 24 h of application, decreasing to 11.77 and 36.80 µg/adult after 48 h, respectively. Between solvent extracts the most active was the one in acetone while among compounds the greatest contact toxicity was observed for α-humulene. Moreover, α-humulene was able to exert the highest average RI (-38.89) against S. granarius adults. As regards to inhalation toxicity, the highest fumigant activity was observed for ß-myrcene with LC50 and LC90 values of 72.78 and 116.92 mg/L in the absence of grain, and 115.78 and 171.42 mg/L in the presence of it. The highest ingestion mortality was detected in acetone extract while the greatest deterrence was found for methanol extract. Negligible anticholinesterase activity was found for all substances in the checked range, with the only exception of ß-caryophyllene which showed a dose dependent inhibitory effect, whereas all free fractions of polyphenols showed anticholinesterase activity. The highest polyphenols content was found for the ecotype collected in 99 Cannelle (78.28 mg/g of dry weight) associated with the highest anticholinesterase activity. Finally, the highest content of alpha and beta acids was recorded in the sample collected in Bussi. This study indicate that wild hop is a source of biological substances which are active on S. granarius adults by contact, ingestion and fumigant toxicity, to be also utilized as low-cost, eco-friendly pests repellents in the protection of stored food. Moreover, the results confirm that the examined hop ecotypes show significant differences in the content of polyphenols, which determine different antioxidant and anti-cholinesterase activities. The latter, in particular, could be responsible for the insecticidal action found previously in alcoholic extracts of ecotypes. These results highlight the need to define the chemical composition of the various fractions in order to characterize the various ecotypes and identify the biologically active molecules.

L'uso indiscriminato di insetticidi sintetici per diversi decenni ha sollevato preoccupazioni per la salute umana, principalmente a causa del loro lento degrado nell'ambiente, dei residui tossici da essi rilasciati e dell'evoluzione della resistenza ai pesticidi nelle popolazioni di parassiti (Isman, 2006). I gravi problemi di resistenza agli insetticidi nei parassiti e la contaminazione della biosfera associata all'uso su larga scala di pesticidi sintetici, hanno portato alla ricerca di prodotti eco-compatibili con maggiore selettività. Questa consapevolezza ha creato un interesse mondiale nello sviluppo di strategie alternative, compresa la scoperta di nuovi insetticidi più ecologici rispetto alle sostanze chimiche sintetiche (Rajashekar et al.,2012a, b; Miresmailli e Isman, 2014). In questo contesto, l'impiego di insetticidi a base di estratti botanici sta suscitando un notevole interesse sia tra i ricercatori che tra i consumatori. È noto che vari composti vegetali si legano ad alcune macromolecole biologiche (principalmente proteine), interagendo con siti specifici all'interno delle cellule. Ultimamente, lo studio sulle interazioni tra sostanze naturali e componenti cellulari ha assunto un ruolo importante nello sviluppo di farmaci sintetici. Ciò potrebbe incoraggiare la ricerca verso l'identificazione di nuovi composti/estratti con attività biologica in quanto costituiscono la base per nuovi approcci biotecnologici alla difesa delle piante e alla loro gestione. Oltre alle nuove classi di insetticidi, sono però necessarie sostanze chimiche che presentano diverse modalità di azione, in modo da mantenere una produzione alimentare stabile (Gokce et al., 2012). La maggior parte delle piante si difende dagli erbivori attraverso la produzione di metaboliti secondari come terpeni, composti fenolici e composti contenenti azoto (Taiz and Zeiger, 2010). Alcuni di questi, tra cui piretrina e rotenone, provocano tossicità diretta, altri causano interruzioni fisiologiche (regolatori della crescita) ed altri ancora vengono utilizzati come repellenti, attrattivi o anti-nutrizionali (Isman, 1999; Gokce et al., 2006). Il luppolo (Humulus lupulus L.) è una pianta perenne e rampicante, utilizzata nei birrifici per aggiungere l’amaro e l’aroma alla birra (Chadwick et al., 2006) la cui produzione è stata stimata di oltre 100.000 tonnellate in tutto il mondo (FAOSTAT, 2014). Tuttavia, parti aeree di questa pianta, producono diversi composti secondari come resine amare, olio essenziale (OE), tannini e terpeni ed hanno dimostrato avere attività biologiche: xantumolo, il principale prenilflavonoide, è stato segnalato possedere effetti antitumorali e antiossidanti (Jacob et al., 2010; Colgate et al ., 2010); gli iso-α-acidi del luppolo influenzano positivamente il metabolismo del glucosio, l'obesità indotta dalla dieta e il relativo declino cognitivo nei roditori (Hiroaki Yajima et al., 2004; Miura et al., 2005; Yajima et al., 2005; Ayabe et al., 2018); i principali composti dell’ OE come α-umulene, β-mircene e β-cariofillene hanno mostrato attività antimicrobiche contro diversi ceppi di batteri Gram-positivi e Gram-negativi (Stompor e Zarowska, 2016). Inoltre, oltre agli impieghi in campo medico (Bocquet et al., 2018), l'interesse per gli estratti/composti derivati dal luppolo sta aumentando, alla luce di un loro possibile utilizzo anche nel controllo dei parassiti. In particolare, diversi articoli hanno evidenziato (Bocquet et al., 2018), attività antinutrizionale e repellente di estratti di luppolo e composti dell’OE di questa pianta (DeGrandi et al., 2012; Powell et al., 1997). Pertanto, nel presente studio l'attenzione è stata focalizzata sull’utilizzo di luppolo selvatico e sulla valutazione dell'attività biologica di estratti, OE e dei suoi principali composti (α-umulene, β-mircene e β-cariofillene) contro il tonchio del grano Sitophilus granarius (L.) (Coleoptera Dryophthoridae). Successivamente, l'attenzione è stata focalizzata sulla caratterizzazione degli ecotipi di luppolo in diverse località dell'Italia centrale (Abruzzo e Molise) al fine di individuarne il migliore in termini di contenuto in polifenoli, associato ad un elevato potere antiossidante. I terpeni, α-umulene, β-mircene e β-cariofillene sono risultati i componenti principali (77,6%) dell’OE. Tra tutti i composti chimici e gli estratti testati, l'OE è stato in grado di esercitare la massima tossicità di contatto con valori di LD50 e LD90 di 13,30 e 40,23 μg/adulto dopo 24 ore dall'applicazione, diminuendo a 11,77 e 36,80 μg/adulto dopo 48 ore, rispettivamente. Tra gli estratti in solvente il più attivo è stato quello in acetone, mentre tra i composti la maggiore tossicità da contatto è stata riscontrata per l'α-umulene. Inoltre, l’α-humulene ha mostrato il miglior indice di repellenza (IR) (-38,89) contro gli adulti di S. granarius. Per quanto riguarda la tossicità per inalazione, la massima attività fumigante è stata osservata per il ß-mircene con valori di LC50 e LC90 di 72,78 e 116,92 mg/L in assenza di grano e 115,78 e 171,42 mg/L in presenza di esso. La massima mortalità per ingestione è stata rilevata nell'estratto in acetone, mentre la maggiore deterrenza per l'estratto in metanolo. L'attività anticolinesterasica è risultata trascurabile per tutte le sostanze, con la sola eccezione del ß-cariofillene, che ha mostrato un effetto inibitorio dose-dipendente, ad eccezione, invece, tutte le frazioni libere di polifenoli che hanno mostrato una buona attività anticolinesterasica. Il più alto contenuto in polifenoli è stato trovato nell’ecotipo raccolto nelle “99 Cannelle” (78,28 mg/g di peso secco) associato alla migliore attività anticolinesterasica. Infine, il contenuto più elevato in alfa e beta acidi è stato registrato nel campione raccolto in “Bussi”. Questo studio indica che il luppolo selvatico potrebbe rappresentare una fonte di sostanze biologicamente attive verso adulti di S. granarius, in quanto ha mostrato una buona tossicità per contatto, ingestione e inalazione, da utilizzare anche come repellente a basso costo ed eco-compatibile nella protezione degli alimenti conservati. Inoltre, i risultati confermano che gli ecotipi di luppolo esaminati mostrano differenze significative nel contenuto in polifenoli, che determinano diverse attività antiossidanti e anti-colinesterasiche. Quest'ultime, in particolare, potrebbero essere responsabili dell'azione insetticida riscontrata precedentemente negli estratti alcolici di alcuni ecotipi. Questi risultati evidenziano, per cui, la necessità di definire la composizione chimica delle varie frazioni al fine di caratterizzare i diversi ecotipi e identificare le molecole biologicamente attive.