In recent years, the market for probiotics has evolved rapidly, thanks mainly to more interest that consumers give to those foods that are marketed primarily for their health benefits. Although many potential benefits of probiotics on human health have been hypothesized, only for few strains there is scientific evidence that demonstrate their beneficial effect. For this reason, it is necessary intensive research aimed at investigating new probiotic strains, their mechanisms of action, and their health properties. The aim of this study is to investigate new potential probiotic strains and to test criteria for their screening. Eight Lactobacillus rhamnosus strains of different origin (infant faeces or cheese), and Akkermansia muciniphila of human origin, were tested in this study. In the first step of this research, the interactions between lactobacilli and prebiotics were investigated, considering eight different strains belonging to Lb. rhamnosus and different prebiotics often found in commercial symbiotic products, such as FOS, lactulose, inulin, mannitol, and sorbitol. The survival and the growth kinetic parameters of Lb. rhamnosus strains cultivated in presence of the different prebiotics as a unique carbon source were evaluated. Moreover, the influence of pre-cultivation in the presence of different prebiotics on the cell surface properties of strains (hydrophobicity, auto-aggregation, co-aggregation) was estimated. Results showed that the conbination of some prebiotics with specific strains can be a stress factor that significantly affects the growth of these strains. In detail, most of the prebiotics used as unique carbon source caused a growth delay compared with glucose, as evidenced by increased values of the lag phase and decreased values of the μmax. Moreover, the results showed significant differences in the cell surface properties (hydrophobicity, auto- and co-aggregation) in the different combinations of strain and prebiotics. Therefore when formulating combinations of prebiotics with probiotics, growth should not be the only parameter taken in to account, since cell surface properties essential to the probiotic function of the strain are also affected. The second part of the research assessed the safety and some probiotic characteristics of the Lb. rhamnosus and A. muciniphila strains for use in humans. Therefore, it was important to test whether the strains could survive in the acidic environment of the stomach, multiply in the intestine even in the presence of bile salts, and be able to 2 adhere to intestinal cells. Therefore, experiments were performed to evaluate the survival at the GI transit, and the adhesion features, such as auto-aggregation, hydrophobicity and adhesion to human cell lines of the tested strains. Another objective of this step of the study was to evaluate whether aggregation capacity and hydrophobicity can be used as a preliminary and rapid screening of the adhesion properties of strains. The results of survival to simulated GI transit evidenced significant differences in the responses of the strains to the stresses encountered. In addition, most Lb. rhamnosus strains have shown a greater sensitivity to exposure to low pH and bile salts, compared to A. muciniphila. Furthermore, this study demonstrates that the exposure to the low pH of the stomach inhibits the survival of Lb. rhamnosus strains to bile-salt induced stress. The results of the adhesion tests to Caco-2, HT29, and MiaPaca-2 cell lines have shown that in the strains tested adhesion is a strain-specific trait, little or not at all influenced by the isolation matrix. The intensity of adhesion to the Caco-2 cell line was the highest using an inoculum of up to 105 CFU/mL in Lb. rhamnosus strains. While a similar adhesion was observed for A. muciniphila in all cell lines. The results obtained indicate, with sufficient degree of reliability, that the characteristics of hydrophobicity and auto-aggregation of the strains do not correlate to their ability to adhere to intestinal tissues.

Negli ultimi anni, il mercato dei probiotici si è evoluto rapidamente, grazie al crescente interesse dei consumatori nei confronti dei prodotti funzionali. Sebbene siano molti i benefici dei probiotici sulla salute umana ad oggi ipotizzati, solo per pochi ceppi l’effetto benefico è stato dimostrato attraverso studi in vivo. Il presente lavoro, inserendosi nel complesso filone della probiosi, ha inteso individuare nuovi ceppi potenzialmente probiotici definendone anche nuovi criteri di selezione. A tal proposito sono stati individuati 8 ceppi di diversa origine appartenenti a Lactobacillus rhamnosus ed un ceppo di Akkermansia muciniphila di origine umana. Nelle prime fasi della ricerca, sono state studiate le interazioni tra lattobacilli e differenti sostanze prebiotiche spesso impiegate in prodotti simbiotici commerciali, quali FOS, lattulosio, inulina, mannitolo e sorbitolo. In particolare è stata valutata la capacità di crescita dei lattobacilli e l'influenza della pre-coltivazione con i diversi prebiotici sulle caratteristiche della superficie cellulare dei ceppi (idrofobicità, auto-aggregazione, co-aggregazione). I risultati hanno mostrato che le combinazioni lattobacillo-prebiotico influenzano significativamente il comportamento dei ceppi condizionandone la capacità di sviluppo, le proprietà della superficie cellulare nonché l’attività antagonista. Pertanto, si evince in maniera chiara che nella progettazione di un prodotto simbiotico occorre indagare il rapporto tra il ceppo di interesse salutistico e la sostanza prebiotica valutando non solo la capacità di sviluppo ma anche l’espressione dei principali caratteri probiotici. Nel successivo periodo di dottorato l’attenzione è stata rivolta alla valutazione di alcuni caratteri funzionali dei ceppi di Lb. rhamnosus, confrontandoli con quelli esibiti dal ceppo tipo di A. muciniphila, ritenuto un probiotico emergente. I benefici dei probiotici sono strettamente connessi all’abilità di questi batteri di superare le condizioni avverse incontrate nel tratto gastro-intestinale e di permanere nell’intestino, che rappresenta il sito target dove esplicano i loro effetti positivi. Pertanto, sono stati condotti esperimenti per valutare la sopravvivenza al transito GI e le caratteristiche di adesione, come l'auto-aggregazione, l'idrofobicità e l'adesione a linee cellulari umane. Inoltre, è stata valuta la correlazione tra le proprietà della superficie cellulare (auto-aggregazione e idrofobicità) e l’adesione a linee cellulari. Dall'analisi dei dati ottenuti è stato riscontrato che i ceppi esibiscono una differente sensibilità alle condizioni di stress simulato nel passaggio gastrointestinale. La maggior parte dei ceppi 4 di Lb. rhamnosus ha mostrato una maggiore sensibilità agli stress rispetto al ceppo riferibile a A. muciniphila. Inoltre, è emerso che la sopravvivenza dei ceppi di Lb. rhamnosus è fortemente inibita in presenza di sali biliari come conseguenza del danno determinato dalla precedente esposizione a pH bassi. I risultati dei test di adesione a linee cellulari Caco2, HT29 e MiaPaca2 hanno evidenziato che tutti i ceppi saggiati hanno un comportamento ceppo-specifico, poco o per nulla influenzato dalla matrice di isolamento. Per quanto riguarda l’intensità di adesione, i ceppi di Lb. rhamnosus hanno mostrato una percentuale di adesione più elevata alle cariche microbiche comprese tra 3 e 5 log CFU/mL solo nel caso della linea cellulare Caco-2, mentre A. muciniphila ha evidenziato il medesimo comportamento su tutte le linee cellulari utilizzate. Infine, è importante sottolineare che i risultati ottenuti indicano, con sufficiente grado di affidabilità, che le caratteristiche di idrofobicità e auto-aggregazione dei ceppi non consentono di presagire la loro capacità di aderire ai tessuti intestinali.

Adhesion properties to human cell lines and other features of probiotic interest in Lactobacillus rhamnosus and Akkermansia muciniphila strains

COZZOLINO, AUTILIA
2019-06-10

Abstract

Negli ultimi anni, il mercato dei probiotici si è evoluto rapidamente, grazie al crescente interesse dei consumatori nei confronti dei prodotti funzionali. Sebbene siano molti i benefici dei probiotici sulla salute umana ad oggi ipotizzati, solo per pochi ceppi l’effetto benefico è stato dimostrato attraverso studi in vivo. Il presente lavoro, inserendosi nel complesso filone della probiosi, ha inteso individuare nuovi ceppi potenzialmente probiotici definendone anche nuovi criteri di selezione. A tal proposito sono stati individuati 8 ceppi di diversa origine appartenenti a Lactobacillus rhamnosus ed un ceppo di Akkermansia muciniphila di origine umana. Nelle prime fasi della ricerca, sono state studiate le interazioni tra lattobacilli e differenti sostanze prebiotiche spesso impiegate in prodotti simbiotici commerciali, quali FOS, lattulosio, inulina, mannitolo e sorbitolo. In particolare è stata valutata la capacità di crescita dei lattobacilli e l'influenza della pre-coltivazione con i diversi prebiotici sulle caratteristiche della superficie cellulare dei ceppi (idrofobicità, auto-aggregazione, co-aggregazione). I risultati hanno mostrato che le combinazioni lattobacillo-prebiotico influenzano significativamente il comportamento dei ceppi condizionandone la capacità di sviluppo, le proprietà della superficie cellulare nonché l’attività antagonista. Pertanto, si evince in maniera chiara che nella progettazione di un prodotto simbiotico occorre indagare il rapporto tra il ceppo di interesse salutistico e la sostanza prebiotica valutando non solo la capacità di sviluppo ma anche l’espressione dei principali caratteri probiotici. Nel successivo periodo di dottorato l’attenzione è stata rivolta alla valutazione di alcuni caratteri funzionali dei ceppi di Lb. rhamnosus, confrontandoli con quelli esibiti dal ceppo tipo di A. muciniphila, ritenuto un probiotico emergente. I benefici dei probiotici sono strettamente connessi all’abilità di questi batteri di superare le condizioni avverse incontrate nel tratto gastro-intestinale e di permanere nell’intestino, che rappresenta il sito target dove esplicano i loro effetti positivi. Pertanto, sono stati condotti esperimenti per valutare la sopravvivenza al transito GI e le caratteristiche di adesione, come l'auto-aggregazione, l'idrofobicità e l'adesione a linee cellulari umane. Inoltre, è stata valuta la correlazione tra le proprietà della superficie cellulare (auto-aggregazione e idrofobicità) e l’adesione a linee cellulari. Dall'analisi dei dati ottenuti è stato riscontrato che i ceppi esibiscono una differente sensibilità alle condizioni di stress simulato nel passaggio gastrointestinale. La maggior parte dei ceppi 4 di Lb. rhamnosus ha mostrato una maggiore sensibilità agli stress rispetto al ceppo riferibile a A. muciniphila. Inoltre, è emerso che la sopravvivenza dei ceppi di Lb. rhamnosus è fortemente inibita in presenza di sali biliari come conseguenza del danno determinato dalla precedente esposizione a pH bassi. I risultati dei test di adesione a linee cellulari Caco2, HT29 e MiaPaca2 hanno evidenziato che tutti i ceppi saggiati hanno un comportamento ceppo-specifico, poco o per nulla influenzato dalla matrice di isolamento. Per quanto riguarda l’intensità di adesione, i ceppi di Lb. rhamnosus hanno mostrato una percentuale di adesione più elevata alle cariche microbiche comprese tra 3 e 5 log CFU/mL solo nel caso della linea cellulare Caco-2, mentre A. muciniphila ha evidenziato il medesimo comportamento su tutte le linee cellulari utilizzate. Infine, è importante sottolineare che i risultati ottenuti indicano, con sufficiente grado di affidabilità, che le caratteristiche di idrofobicità e auto-aggregazione dei ceppi non consentono di presagire la loro capacità di aderire ai tessuti intestinali.
In recent years, the market for probiotics has evolved rapidly, thanks mainly to more interest that consumers give to those foods that are marketed primarily for their health benefits. Although many potential benefits of probiotics on human health have been hypothesized, only for few strains there is scientific evidence that demonstrate their beneficial effect. For this reason, it is necessary intensive research aimed at investigating new probiotic strains, their mechanisms of action, and their health properties. The aim of this study is to investigate new potential probiotic strains and to test criteria for their screening. Eight Lactobacillus rhamnosus strains of different origin (infant faeces or cheese), and Akkermansia muciniphila of human origin, were tested in this study. In the first step of this research, the interactions between lactobacilli and prebiotics were investigated, considering eight different strains belonging to Lb. rhamnosus and different prebiotics often found in commercial symbiotic products, such as FOS, lactulose, inulin, mannitol, and sorbitol. The survival and the growth kinetic parameters of Lb. rhamnosus strains cultivated in presence of the different prebiotics as a unique carbon source were evaluated. Moreover, the influence of pre-cultivation in the presence of different prebiotics on the cell surface properties of strains (hydrophobicity, auto-aggregation, co-aggregation) was estimated. Results showed that the conbination of some prebiotics with specific strains can be a stress factor that significantly affects the growth of these strains. In detail, most of the prebiotics used as unique carbon source caused a growth delay compared with glucose, as evidenced by increased values of the lag phase and decreased values of the μmax. Moreover, the results showed significant differences in the cell surface properties (hydrophobicity, auto- and co-aggregation) in the different combinations of strain and prebiotics. Therefore when formulating combinations of prebiotics with probiotics, growth should not be the only parameter taken in to account, since cell surface properties essential to the probiotic function of the strain are also affected. The second part of the research assessed the safety and some probiotic characteristics of the Lb. rhamnosus and A. muciniphila strains for use in humans. Therefore, it was important to test whether the strains could survive in the acidic environment of the stomach, multiply in the intestine even in the presence of bile salts, and be able to 2 adhere to intestinal cells. Therefore, experiments were performed to evaluate the survival at the GI transit, and the adhesion features, such as auto-aggregation, hydrophobicity and adhesion to human cell lines of the tested strains. Another objective of this step of the study was to evaluate whether aggregation capacity and hydrophobicity can be used as a preliminary and rapid screening of the adhesion properties of strains. The results of survival to simulated GI transit evidenced significant differences in the responses of the strains to the stresses encountered. In addition, most Lb. rhamnosus strains have shown a greater sensitivity to exposure to low pH and bile salts, compared to A. muciniphila. Furthermore, this study demonstrates that the exposure to the low pH of the stomach inhibits the survival of Lb. rhamnosus strains to bile-salt induced stress. The results of the adhesion tests to Caco-2, HT29, and MiaPaca-2 cell lines have shown that in the strains tested adhesion is a strain-specific trait, little or not at all influenced by the isolation matrix. The intensity of adhesion to the Caco-2 cell line was the highest using an inoculum of up to 105 CFU/mL in Lb. rhamnosus strains. While a similar adhesion was observed for A. muciniphila in all cell lines. The results obtained indicate, with sufficient degree of reliability, that the characteristics of hydrophobicity and auto-aggregation of the strains do not correlate to their ability to adhere to intestinal tissues.
Adhesion; Probiotic; Prebiotic
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