Neurological diseases are a heterogeneous group of pathologies characterized, in many cases, by a strong clinical and genetic heterogeneity. Examples of this are spastic paraplegia and ataxia, in which the genetic component is in many cases difficult to frame. While many of these patients fail to identify this component, others receive a clinical diagnosis in which the gene responsible for the phenotype is identified. In such patients, genetic analysis must regard the incomplete penetrance, and the presence of "private" mutations (described only in some families). Moreover, the difficulty in carrying out multicentric studies with homogeneously selected patients makes it difficult to develop specific databases in which the gene variants are reported, and the clinical phenotype associated with them. Regarding the phenotype, the clinical and molecular diagnostics find more difficulties in the most complex forms, in which spasticity or ataxia are only a component of much more complex clinical syndrome. Next Generation Sequencing (NGS) technologies have solved the problem of "polygenicity", making it possible to analyze multiple genes simultaneously, including the analysis of the whole genome. To date, carefully designed and validated panels have become part of clinical practice. The application of these technologies in neurological diseases is more complex because it requires a careful selection of genes to be analyzed. Moreover, considering the high allelic heterogeneity, it is difficult to establish a correct detection rate (% of identified positives), and therefore to develop easy-to-use panels in molecular diagnostics. In light of these observations, the thesis had the following objectives: • Design, develop and validate a panel of genes based on NGS technology (NGS target panel) for the diagnosis of patients characterized by ataxia and / or spasticity • To evaluate the usefulness of the NGS analysis of all the coding genes associated with Mendelian pathologies (clinical exome) for a correct classification of complex neurological phenotypes. The study was conducted on 78 ataxic and / or spastic patients recruited at the IRCCS Neuromed. The genetic component potentially responsible for the clinical phenotype was identified in 21% of the patients analyzed by the target NGS Panel, and in 13% of the patients analyzed by clinical exome. The study showed that NGS panels, carefully designed and validated, can be applied to the molecular diagnosis of neurological pathologies characterized by polygenicity and clinical variability. The validation of these clinical strategies requires the careful and homogeneous selection of the cases. This allows to delineate the correct diagnostic use, thus increasing the detection rate. It is also essential to use a very stringent and reproducible interpretation of the variants. This is confirmed in the present study, where the joint use of family segregation analysis (where possible) and bioinformatics analysis, is fundamental for the identification of pathological variants. For a correct diagnostic classification of the complex phenotypes it was useful to apply larger panels, such as the clinical exome.

Le malattie neurologiche sono un gruppo eterogeneo di patologie caratterizzate, in molti casi, da una forte eterogeneità clinica e genetica. Ne sono un esempio le atassie e le paraparesi spastiche, in cui la componente genetica risulta in molti casi di difficile inquadramento. Se da un lato in molti di questi pazienti non si riesce ad identificare tale componente, altri invece ricevono una diagnosi clinica nella quale viene identificato il gene responsabile del fenotipo. In tali pazienti, l’analisi genetica deve tener conto dalla penetranza incompleta, e dalla presenza di mutazioni “private” (descritte solamente in alcune famiglie). Oltretutto, la difficoltà nell’eseguire studi multicentrici con pazienti selezionati in modo omogeneo, rende difficile sviluppare dei database specifici in cui siano riportate le varianti geniche, ed il fenotipo clinico ad esse associate. Per quanto riguarda il fenotipo, la diagnostica clinica e molecolare trovano maggiori difficoltà nelle forme più complesse, in cui la spasticità o la atassia sono solamente una componente di quadri clinici ben più complessi. Le tecnologie di Next Generation Sequencing (NGS) hanno risolto la problematica della “poligenicità”, rendendo possibile l’analisi contemporanea di più geni, consentendo anche l’analisi di tutto il genoma. Ad oggi, pannelli accuratamente disegnati e validati sono entrati a far parte della pratica clinica. L’applicazione di queste tecnologie nelle patologie neurologiche è più complessa perché richiede una accurata selezione dei geni da analizzare. Inoltre, considerata l’elevata eterogeneità allelica, risulta difficile stabilire una corretta detection rate (% dei positivi identificati), e quindi sviluppare dei pannelli di facile utilizzo in diagnostica molecolare. Alla luce di queste osservazioni, la tesi ha avuto i seguenti obiettivi: • Disegnare, sviluppare e validare un pannello di geni basato su tecnologia NGS (Pannello NGS target) per la diagnosi di pazienti caratterizzati da atassia e/o spasticità • Valutare l’utilità dell’analisi NGS di tutti i geni codificanti associati a patologie mendeliane (Esoma clinico) per un corretto inquadramento di fenotipi neurologici complessi. Lo studio è stato condotto su 78 pazienti atassici e/o spastici reclutati presso l’IRCCS Neuromed. È stata identificata la componente genetica potenzialmente responsabile del fenotipo clinico nel 21% dei pazienti sottoposti ad analisi mediante Pannello NGS target, e nel 13% dei pazienti sottoposti ad esoma clinico. Lo studio ha dimostrato che pannelli NGS, accuratamente disegnati e validati, possano essere applicati alla diagnosi molecolare di patologie neurologiche caratterizzate da poligenicità e variabilità clinica. La validazione di questi percorsi richiede la selezione accurata ed omogenea della casistica. Questo consente di delinearne il corretto utilizzo diagnostico, aumentando così la detection rate. Risulta inoltre fondamentale l’utilizzo di un iter di interpretazione delle varianti molto stringente e riproducibile. Questo viene confermato nel presente studio, dove l’utilizzo congiunto di analisi di segregazione familiare (ove possibile) ed analisi bioinformatica, è fondamentale per l’identificazione delle varianti patologiche. Per un corretto inquadramento diagnostico dei fenotipi complessi è risultato utile applicare pannelli più estesi, come l’esoma clinico.

Sviluppo di un percorso diagnostico mediante tecnologia NGS per la caratterizazione molecolare di pazienti atasso spastici e pazienti con fenotipi neurologici complessi

Campopiano, Rosa
2019-03-06

Abstract

Le malattie neurologiche sono un gruppo eterogeneo di patologie caratterizzate, in molti casi, da una forte eterogeneità clinica e genetica. Ne sono un esempio le atassie e le paraparesi spastiche, in cui la componente genetica risulta in molti casi di difficile inquadramento. Se da un lato in molti di questi pazienti non si riesce ad identificare tale componente, altri invece ricevono una diagnosi clinica nella quale viene identificato il gene responsabile del fenotipo. In tali pazienti, l’analisi genetica deve tener conto dalla penetranza incompleta, e dalla presenza di mutazioni “private” (descritte solamente in alcune famiglie). Oltretutto, la difficoltà nell’eseguire studi multicentrici con pazienti selezionati in modo omogeneo, rende difficile sviluppare dei database specifici in cui siano riportate le varianti geniche, ed il fenotipo clinico ad esse associate. Per quanto riguarda il fenotipo, la diagnostica clinica e molecolare trovano maggiori difficoltà nelle forme più complesse, in cui la spasticità o la atassia sono solamente una componente di quadri clinici ben più complessi. Le tecnologie di Next Generation Sequencing (NGS) hanno risolto la problematica della “poligenicità”, rendendo possibile l’analisi contemporanea di più geni, consentendo anche l’analisi di tutto il genoma. Ad oggi, pannelli accuratamente disegnati e validati sono entrati a far parte della pratica clinica. L’applicazione di queste tecnologie nelle patologie neurologiche è più complessa perché richiede una accurata selezione dei geni da analizzare. Inoltre, considerata l’elevata eterogeneità allelica, risulta difficile stabilire una corretta detection rate (% dei positivi identificati), e quindi sviluppare dei pannelli di facile utilizzo in diagnostica molecolare. Alla luce di queste osservazioni, la tesi ha avuto i seguenti obiettivi: • Disegnare, sviluppare e validare un pannello di geni basato su tecnologia NGS (Pannello NGS target) per la diagnosi di pazienti caratterizzati da atassia e/o spasticità • Valutare l’utilità dell’analisi NGS di tutti i geni codificanti associati a patologie mendeliane (Esoma clinico) per un corretto inquadramento di fenotipi neurologici complessi. Lo studio è stato condotto su 78 pazienti atassici e/o spastici reclutati presso l’IRCCS Neuromed. È stata identificata la componente genetica potenzialmente responsabile del fenotipo clinico nel 21% dei pazienti sottoposti ad analisi mediante Pannello NGS target, e nel 13% dei pazienti sottoposti ad esoma clinico. Lo studio ha dimostrato che pannelli NGS, accuratamente disegnati e validati, possano essere applicati alla diagnosi molecolare di patologie neurologiche caratterizzate da poligenicità e variabilità clinica. La validazione di questi percorsi richiede la selezione accurata ed omogenea della casistica. Questo consente di delinearne il corretto utilizzo diagnostico, aumentando così la detection rate. Risulta inoltre fondamentale l’utilizzo di un iter di interpretazione delle varianti molto stringente e riproducibile. Questo viene confermato nel presente studio, dove l’utilizzo congiunto di analisi di segregazione familiare (ove possibile) ed analisi bioinformatica, è fondamentale per l’identificazione delle varianti patologiche. Per un corretto inquadramento diagnostico dei fenotipi complessi è risultato utile applicare pannelli più estesi, come l’esoma clinico.
Development of a diagnostic strategy by NGS technology for molecular characterization of patients with spastic ataxia and patients with complex neurological phenotypes
Neurological diseases are a heterogeneous group of pathologies characterized, in many cases, by a strong clinical and genetic heterogeneity. Examples of this are spastic paraplegia and ataxia, in which the genetic component is in many cases difficult to frame. While many of these patients fail to identify this component, others receive a clinical diagnosis in which the gene responsible for the phenotype is identified. In such patients, genetic analysis must regard the incomplete penetrance, and the presence of "private" mutations (described only in some families). Moreover, the difficulty in carrying out multicentric studies with homogeneously selected patients makes it difficult to develop specific databases in which the gene variants are reported, and the clinical phenotype associated with them. Regarding the phenotype, the clinical and molecular diagnostics find more difficulties in the most complex forms, in which spasticity or ataxia are only a component of much more complex clinical syndrome. Next Generation Sequencing (NGS) technologies have solved the problem of "polygenicity", making it possible to analyze multiple genes simultaneously, including the analysis of the whole genome. To date, carefully designed and validated panels have become part of clinical practice. The application of these technologies in neurological diseases is more complex because it requires a careful selection of genes to be analyzed. Moreover, considering the high allelic heterogeneity, it is difficult to establish a correct detection rate (% of identified positives), and therefore to develop easy-to-use panels in molecular diagnostics. In light of these observations, the thesis had the following objectives: • Design, develop and validate a panel of genes based on NGS technology (NGS target panel) for the diagnosis of patients characterized by ataxia and / or spasticity • To evaluate the usefulness of the NGS analysis of all the coding genes associated with Mendelian pathologies (clinical exome) for a correct classification of complex neurological phenotypes. The study was conducted on 78 ataxic and / or spastic patients recruited at the IRCCS Neuromed. The genetic component potentially responsible for the clinical phenotype was identified in 21% of the patients analyzed by the target NGS Panel, and in 13% of the patients analyzed by clinical exome. The study showed that NGS panels, carefully designed and validated, can be applied to the molecular diagnosis of neurological pathologies characterized by polygenicity and clinical variability. The validation of these clinical strategies requires the careful and homogeneous selection of the cases. This allows to delineate the correct diagnostic use, thus increasing the detection rate. It is also essential to use a very stringent and reproducible interpretation of the variants. This is confirmed in the present study, where the joint use of family segregation analysis (where possible) and bioinformatics analysis, is fundamental for the identification of pathological variants. For a correct diagnostic classification of the complex phenotypes it was useful to apply larger panels, such as the clinical exome.
Atassia; Paraparesi spastica; Diagnostica molecolare; Next generation sequencing
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