Epileptic Encephalopathy (EE) is a severe form of epilepsy in which epileptiform activity contributes to a progressive cerebral dysfunction. Recently, mutations in the kcnq2 or kcnq3 genes have been identified in patients affected by EE. These genes encode for neuronal Kv7.2 or Kv7.3 subunits characterized by the presence of six transmembrane segments and a long C-terminus domain to which several modulatory proteins are associated, such as the phosphatidylinositol-4-5-bis-phosphate (PIP2), that is a know Kv7 activator, and the calmodulin (CaM). The heteromeric channels underlie the neuronal M current, a potassium current which inhibits neuronal excitability. The aim of this work is to study the functional consequences and the pharmacological sensitivity of Kv7.2 or Kv7.3 channels incorporating the following mutations: • Kv7.2 R325G identified in three patients affected by EE; • two mutations in the kcnq3 gene in compound heterozygosis identified in a patient affected by EE (Kv7.3 V359L/Kv7.3 D542N) and the Kv7.2 D535N corresponding to the Kv7.3 D542N variant and described in three cases with EE; • Kv7.2 G310S identified in a patient with EE. To study this mutation channel subunits were expressed in CHO cells by transient transfection. One day after transfection, we recorded the currents by whole cell patch-clamp. Patch-clamp recordings revealed that homomeric mutant channel are not functional when compared to homomeric Kv7.2 or Kv7.3 wild-type (wt) channels. To reproduce the genetic balance of EE-affected patients, mutant subunits were co-expressed with Kv7.2 or Kv7.3 wt subunits. The results obtained suggest that heteromeric mutant channels carried currents size smaller than those from heteromeric wt channels. Based on these results, we therefore tested the activator drug, called retigabine, that was able to restore, at wt levels, the currents carried by heteromeric mutant channels. To better understand the pathogenic mechanism induced by the mutations, we used a structural model in which was possible to reproduce a portion of Kv7.2 or Kv7.3 channels. The residues of our interest are involved in the binding-site of PIP2 and are near to the binding-site of CaM. To this aim, we used two experimental tools: a PIP2-synthesizing enzyme, called PIP5K, that increses PIP2 levels, or a phosphatase, like DrVSP, which reduces PIP2 levels. PIP5K co-expression with Kv7.2 homomeric mutant channels significantly increased current size. On the other end, this effect was not observed for Kv7.3 mutant channels. DrVSP experiments showed that heteromeric mutant currents is more easily inhibeted by DrVSP e more slowly recovered, when compared to heteromeric wt channels. These results suggest that the studied mutations interfere with the PIP2-dependent regulation. Furthermore, a significant current size increase was observed by the co-expression of CaM1234 (a mutated calmodulin that does not bind calcium) with Kv7.2 D535N and Kv7.2 G310S mutant channels, suggesting that these channels also interfere with CaM regulation. In conclusions, the mutations herein investigated causes a loss of function by interfering with the PIP2 regulation and, in some cases, also with the CaM regulation. Moreover, these results provide a rationale for the use of Kv7 channels activators, like retigabine or retigabine derivates, for the pharmacological treatment of patients affected by EE carrying Kv7 loss-of-function mutations.

L’Encefalopatia Epilettica (EE) è una condizione clinica severa che causa un grave ritardo cognitivo e neurologico. Recentemente, sono state identificate mutazioni associate ad EE nei geni kcnq2 e kcnq3 che codificano rispettivamente per le subunità del potassio voltaggio-dipendenti Kv7.2 e Kv7.3. Ciascuna subunità è formata da 6 segmenti transmembrana e da un lungo dominio C-terminale a cui possono legarsi diverse molecole regolatorie quali il fostatidil-inositolo-(4,5)-bisfosfato (PIP2), un importante attivatore dei canali Kv7, e la calmodulina (CaM). I canali maturi sono formati dall’assemblaggio eteromerico delle subunità Kv7.2 e Kv7.3 e sottendono una corrente del potassio detta “corrente M” che inibisce l’eccitabilità neuronale. Lo scopo del presente lavoro è stato quello di investigare le conseguenze funzionali e la sensibilità farmacologica delle seguenti mutazioni: • Kv7.2 R325G identificata in tre soggetti con EE; • due varianti in eterozigosi composta nel gene kcnq3 riscontrate in un soggetto con EE (Kv7.3 V359L/Kv7.3 D542N) e la mutazione Kv7.2 D535N, corrispondente alla variante Kv7.3 D542N, descritta in tre casi con epilessia neonatale; • Kv7.2 G310S riscontrata in un paziente con EE. Al fine di studiare tali mutazioni cellule CHO sono state trasfettate con le subunità di interesse e le correnti espresse dalle cellule sono state registrate mediante la tecnica del patch-clamp in configurazione whole-cell. Dagli esperimenti di elettrofisiologia è emerso che i canali omomerici mutanti non sono funzionali rispetto ai controlli rappresentati dai canali Kv7.2 o Kv7.3 wild-type (wt). Al fine di riprodurre il bilancio genico dei probandi in studio, le subunità mutanti sono state espresse in configurazione eteromerica con le subunità Kv7.2 e Kv7.3 wt ed è stata osservata una significativa riduzione della densità di corrente dei canali eteromerici mutanti rispetto al canale eteromerico wt. Sulla base di questi risultati, è stato testato il farmaco attivatore retigabina che ha consentito di ripristinare, ai livelli del wt, la corrente elicitata dai canali eteromerici mutanti. Per comprendere il possibile meccanismo responsabile dell’effetto indotto dalle mutazioni è stato utilizzato un modello strutturale delle subunità Kv7.2 o Kv7.3 da cui è emerso che i residui di interesse sono localizzati in un sito di legame per il PIP2 e adiacenti al sito di legame per la CaM. Pertanto, sono stati condotti ulteriori esperimenti di elettrofisiologia utilizzando la chinasi PIP5K che incrementa i livelli di PIP2 o la fosfatasi DrVSP che ne riduce i livelli. La co-espressione della PIP5K con i canali Kv7.2 omomerici mutanti ha consentito un significativo aumento della densità di corrente. Al contrario, tale effetto non è stato osservato per i canali Kv7.3 mutanti. Gli esperimenti con la DrVSP hanno mostrato un maggiore effetto di inibizione ed una più lenta cinetica di recupero della corrente espressa dai canali eteromerici mutanti rispetto a quella misurata per il canale wt. Tali risultati suggeriscono che le mutazioni in studio alterano la regolazione della corrente M mediata dal PIP2. Un significativo recupero della funzionalità del canale è stato anche osservato dalla co-espressione dei canali Kv7.2 D535N e Kv7.2 G310S con la CaM1234 (una calmodulina mutata che non lega il calcio), suggerendo che per tali canali mutanti risulta compromessa anche la regolazione dipendente dalla calmodulina. In conclusione, le mutazioni studiate causano una completa perdita di funzione dei canali probabilmente in seguito all’alterata regolazione operata dal PIP2 e, in alcuni casi, dalla calmodulina. Infine, tali risultati forniscono un razionale per l’uso di attivatori, quali la retigabina o suoi analoghi, per il trattamento di pazienti affetti da EE e portatori di tali mutazioni.

Identificazione di un nuovo meccanismo molecolare e correlazioni genotipo-fenotipo nelle encefalopatie dello sviluppo associate a varianti nei geni KCNQ2 e KCNQ3

MOSCA, Ilaria
2019-03-06

Abstract

L’Encefalopatia Epilettica (EE) è una condizione clinica severa che causa un grave ritardo cognitivo e neurologico. Recentemente, sono state identificate mutazioni associate ad EE nei geni kcnq2 e kcnq3 che codificano rispettivamente per le subunità del potassio voltaggio-dipendenti Kv7.2 e Kv7.3. Ciascuna subunità è formata da 6 segmenti transmembrana e da un lungo dominio C-terminale a cui possono legarsi diverse molecole regolatorie quali il fostatidil-inositolo-(4,5)-bisfosfato (PIP2), un importante attivatore dei canali Kv7, e la calmodulina (CaM). I canali maturi sono formati dall’assemblaggio eteromerico delle subunità Kv7.2 e Kv7.3 e sottendono una corrente del potassio detta “corrente M” che inibisce l’eccitabilità neuronale. Lo scopo del presente lavoro è stato quello di investigare le conseguenze funzionali e la sensibilità farmacologica delle seguenti mutazioni: • Kv7.2 R325G identificata in tre soggetti con EE; • due varianti in eterozigosi composta nel gene kcnq3 riscontrate in un soggetto con EE (Kv7.3 V359L/Kv7.3 D542N) e la mutazione Kv7.2 D535N, corrispondente alla variante Kv7.3 D542N, descritta in tre casi con epilessia neonatale; • Kv7.2 G310S riscontrata in un paziente con EE. Al fine di studiare tali mutazioni cellule CHO sono state trasfettate con le subunità di interesse e le correnti espresse dalle cellule sono state registrate mediante la tecnica del patch-clamp in configurazione whole-cell. Dagli esperimenti di elettrofisiologia è emerso che i canali omomerici mutanti non sono funzionali rispetto ai controlli rappresentati dai canali Kv7.2 o Kv7.3 wild-type (wt). Al fine di riprodurre il bilancio genico dei probandi in studio, le subunità mutanti sono state espresse in configurazione eteromerica con le subunità Kv7.2 e Kv7.3 wt ed è stata osservata una significativa riduzione della densità di corrente dei canali eteromerici mutanti rispetto al canale eteromerico wt. Sulla base di questi risultati, è stato testato il farmaco attivatore retigabina che ha consentito di ripristinare, ai livelli del wt, la corrente elicitata dai canali eteromerici mutanti. Per comprendere il possibile meccanismo responsabile dell’effetto indotto dalle mutazioni è stato utilizzato un modello strutturale delle subunità Kv7.2 o Kv7.3 da cui è emerso che i residui di interesse sono localizzati in un sito di legame per il PIP2 e adiacenti al sito di legame per la CaM. Pertanto, sono stati condotti ulteriori esperimenti di elettrofisiologia utilizzando la chinasi PIP5K che incrementa i livelli di PIP2 o la fosfatasi DrVSP che ne riduce i livelli. La co-espressione della PIP5K con i canali Kv7.2 omomerici mutanti ha consentito un significativo aumento della densità di corrente. Al contrario, tale effetto non è stato osservato per i canali Kv7.3 mutanti. Gli esperimenti con la DrVSP hanno mostrato un maggiore effetto di inibizione ed una più lenta cinetica di recupero della corrente espressa dai canali eteromerici mutanti rispetto a quella misurata per il canale wt. Tali risultati suggeriscono che le mutazioni in studio alterano la regolazione della corrente M mediata dal PIP2. Un significativo recupero della funzionalità del canale è stato anche osservato dalla co-espressione dei canali Kv7.2 D535N e Kv7.2 G310S con la CaM1234 (una calmodulina mutata che non lega il calcio), suggerendo che per tali canali mutanti risulta compromessa anche la regolazione dipendente dalla calmodulina. In conclusione, le mutazioni studiate causano una completa perdita di funzione dei canali probabilmente in seguito all’alterata regolazione operata dal PIP2 e, in alcuni casi, dalla calmodulina. Infine, tali risultati forniscono un razionale per l’uso di attivatori, quali la retigabina o suoi analoghi, per il trattamento di pazienti affetti da EE e portatori di tali mutazioni.
Identification of a new molecular mechanism and genotype-phenotype correlations in the developmental encephalopathies associated to mutations in KCNQ2 and KCNQ3 genes
Epileptic Encephalopathy (EE) is a severe form of epilepsy in which epileptiform activity contributes to a progressive cerebral dysfunction. Recently, mutations in the kcnq2 or kcnq3 genes have been identified in patients affected by EE. These genes encode for neuronal Kv7.2 or Kv7.3 subunits characterized by the presence of six transmembrane segments and a long C-terminus domain to which several modulatory proteins are associated, such as the phosphatidylinositol-4-5-bis-phosphate (PIP2), that is a know Kv7 activator, and the calmodulin (CaM). The heteromeric channels underlie the neuronal M current, a potassium current which inhibits neuronal excitability. The aim of this work is to study the functional consequences and the pharmacological sensitivity of Kv7.2 or Kv7.3 channels incorporating the following mutations: • Kv7.2 R325G identified in three patients affected by EE; • two mutations in the kcnq3 gene in compound heterozygosis identified in a patient affected by EE (Kv7.3 V359L/Kv7.3 D542N) and the Kv7.2 D535N corresponding to the Kv7.3 D542N variant and described in three cases with EE; • Kv7.2 G310S identified in a patient with EE. To study this mutation channel subunits were expressed in CHO cells by transient transfection. One day after transfection, we recorded the currents by whole cell patch-clamp. Patch-clamp recordings revealed that homomeric mutant channel are not functional when compared to homomeric Kv7.2 or Kv7.3 wild-type (wt) channels. To reproduce the genetic balance of EE-affected patients, mutant subunits were co-expressed with Kv7.2 or Kv7.3 wt subunits. The results obtained suggest that heteromeric mutant channels carried currents size smaller than those from heteromeric wt channels. Based on these results, we therefore tested the activator drug, called retigabine, that was able to restore, at wt levels, the currents carried by heteromeric mutant channels. To better understand the pathogenic mechanism induced by the mutations, we used a structural model in which was possible to reproduce a portion of Kv7.2 or Kv7.3 channels. The residues of our interest are involved in the binding-site of PIP2 and are near to the binding-site of CaM. To this aim, we used two experimental tools: a PIP2-synthesizing enzyme, called PIP5K, that increses PIP2 levels, or a phosphatase, like DrVSP, which reduces PIP2 levels. PIP5K co-expression with Kv7.2 homomeric mutant channels significantly increased current size. On the other end, this effect was not observed for Kv7.3 mutant channels. DrVSP experiments showed that heteromeric mutant currents is more easily inhibeted by DrVSP e more slowly recovered, when compared to heteromeric wt channels. These results suggest that the studied mutations interfere with the PIP2-dependent regulation. Furthermore, a significant current size increase was observed by the co-expression of CaM1234 (a mutated calmodulin that does not bind calcium) with Kv7.2 D535N and Kv7.2 G310S mutant channels, suggesting that these channels also interfere with CaM regulation. In conclusions, the mutations herein investigated causes a loss of function by interfering with the PIP2 regulation and, in some cases, also with the CaM regulation. Moreover, these results provide a rationale for the use of Kv7 channels activators, like retigabine or retigabine derivates, for the pharmacological treatment of patients affected by EE carrying Kv7 loss-of-function mutations.
Encefalopatia epilettica; Kv7; PIP2; Calmodulina; Corrente M; Retigabina
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