Midbrain dopaminergic neurons (mDA) development is a complex and still not fully understood phenomenon. Many studies till now concentrated their attention on the roles played by several, specific and well-known transcription factors. The aim of my PhD thesis is focus on a relatively new class of post-transcriptional regulators named microRNAs (miRNAs) able to regulate gene expression by targeting partially complementary sequences in the 3’untranslated regions (UTRs) of the target mRNAs. To investigate the role played by miRNAs during mDA differentiation, we choose to analyze miRNAs expression profile by using miRNA Array platforms. To this purpose we used an optimized protocol from mouse Epiblast stem cells (epiSC) differentiated into DA neurons (Jeager et al. 2011). By bioinformatics analysis of the array data, obtained from epiSC differentiated into mDA neurons, we identified few candidates most likely implicated in the DA neurons differentiation and function. The candidate miRNAs were screened for their ability to induce DA phenotype. To this purpose, I generated inducible lentiviral vectors for each miRNA and I have infected mesencephalic primary cultures from mice at stage E12.5. Among all candidate miRNAs, miR-218 and miR-34b/c increase the number of TH+ positive cells, showing their possible contribution in the mDA neurons. Moreover, miR-218 and miR-34b/c, were enriched both in midbrain of mice (E13.5) and in FACS sorted GFP+ cells isolated from E13.5 Pitx3-GFP mice embryos when compared with control. Data obtained from Luciferase Assay and Dual Fluorescence Reporter Assay suggest that miR-34b/c target and suppress Wnt1 3’UTR and it is expressed during DA neurons differentiation. By performing In situ hybridization analysis and immunohistochemistry, I was able to detect miR-218 in particular in the mouse midbrain at stage E14, where co-localize rostrally with Isl-1 (motor neuron marker) and caudally with TH, Pitx3, Lmx1a (dopaminergic marker). This data suggests that miR-218 is expressed also in cranial motor neurons, as described in others recent studies (Thiebes, K.P. et al. 2014; Amin, N.D et al. 2015). To further understand the role of miR-218 in development and function of dopaminergic neurons I have generated the conditional knock-out (cKO) mice for miR-218-2. By mating miR-218-2 flox/flox with En1Cre/+ mice expressing the Cre under Engrailed 1 promoter (En1 is a pro-dopaminergic marker) I will be able to investigate the contribution of miR-218 in dopaminergic system. Preliminary observations on miR-218-2 flox/flox En1Cre/+ mice shown motor impairment phenotype, but to confirm this data I’m currently performing behavior tests and in vivo analysis. Through miRNA expression profiling we be able understand mechanism and function of dopaminergic system, because miRNAs are as key regulators in gene expression networks, can influence many biological processes and have also shown promise as biomarkers for neuro-disorders.

Lo sviluppo dei neuroni dopaminergici mesencefalici (mDA) è un fenomeno complesso e non ancora pienamente compreso. Molti studi hanno focalizzato la loro attenzione sul ruolo svolto da diversi fattori di trascrizione specifici e ben noti. L'obiettivo della mia tesi di dottorato è focalizzato su una classe relativamente nuova di regolatori post-trascrizionali denominati microRNA (miRNAs), in grado di regolare l'espressione genica legando le sequenze parzialmente complementari nelle regioni 3' non tradotte (UTR) degli mRNAs target. Per studiare il ruolo svolto dai miRNAs durante la differenziazione dei neuroni mDA, abbiamo scelto di analizzare il profilo di espressione dei miRNA usando piattaforme di Array. A tale scopo, abbiamo utilizzato un protocollo ottimizzato da cellule staminali di epiblasto di topo (epiSC) differenziate in neuroni mDA (Jeager et al.,2011). Dall'analisi bioinformatica dei dati dell'array, ottenuti dalle epiSC differenziate in neuroni mDA, abbiamo identificato alcuni candidati molto probabilmente implicati nella differenziazione e nella funzione dei neuroni DA. I miRNA candidati sono stati sottoposti a screening per la loro capacità di indurre il fenotipo DA. A questo scopo, ho generato vettori lentivirali inducibili per ciascun miRNAs e ho infettato colture primarie mesencefaliche di topo allo stadio E12.5. Tra tutti i miRNA candidati, miR-218 e miR-34b/c aumentano il numero di cellule TH + positive, suggerendo il loro possibile contributo nei neuroni mDA. Inoltre, miR-218 e miR-34b/c, risultano arricchiti sia nel mesencefalo dei topi (E13.5) che nelle cellule GFP + sortate al FACS, isolate da embrioni E13.5 Pitx3-GFP di topo, rispetto al controllo. I dati ottenuti dal saggio di Luciferasi e dal saggio di reporter a doppia fluorescenza suggeriscono che miR-34b/c legano e sopprimono la 3'UTR di Wnt1 e viene espresso durante la differenziazione dei neuroni mDA. Tramite analisi di ibridazione in situ e dati d’ immunoistochimica ho potuto verificare che miR-218 è espresso in particolare nel mesencefalo di topo allo stadio E14, dove co-localizza rostralmente con Isl-1 (marcatore di motoneuroni) e caudalmente con TH, Pitx3, Lmx1a (marcatori dopaminergico). Questi dati suggeriscono che miR-218 è espresso anche nei motoneuroni craniali, come descritto in altri recenti studi (Thiebes, K.P. et al., 2014; Amin, N.D et al., 2015). Per comprendere ulteriormente il ruolo di miR-218 nello sviluppo e nella funzione dei neuroni dopaminergici ho generato topi knock-out condizionali (cKO) per miR-218-2. Accoppiando miR-218-2 flox / flox con topi En1Cre /+ che esprimono Cre sotto il controllo del promotore di Engrailed 1 (En1, marker pro-dopaminergico), sarò in grado di comprendere il contributo di miR-218 nel sistema dopaminergico. I topi miR-218-2 flox / flox En1Cre /+ da osservazioni preliminari, hanno mostrato un fenotipo con danno motorio, ma per confermare questi dati sto attualmente effettuando test comportamentali e analisi in vivo. Attraverso il profilo di espressione di miRNAs, siamo in grado di comprendere il meccanismo e la funzione del sistema dopaminergico, poiché i miRNAs sono regolatori chiave nelle reti di espressione genica, possono influenzare molti processi biologici e in futuro potrebbero essere utilizzati come biomarkers per diagnosticare patologie legate al sistema nervoso.

MicroRNAs profiling in Dopaminergic neurons

DE SANCTIS, Claudia
2018-03-20

Abstract

Lo sviluppo dei neuroni dopaminergici mesencefalici (mDA) è un fenomeno complesso e non ancora pienamente compreso. Molti studi hanno focalizzato la loro attenzione sul ruolo svolto da diversi fattori di trascrizione specifici e ben noti. L'obiettivo della mia tesi di dottorato è focalizzato su una classe relativamente nuova di regolatori post-trascrizionali denominati microRNA (miRNAs), in grado di regolare l'espressione genica legando le sequenze parzialmente complementari nelle regioni 3' non tradotte (UTR) degli mRNAs target. Per studiare il ruolo svolto dai miRNAs durante la differenziazione dei neuroni mDA, abbiamo scelto di analizzare il profilo di espressione dei miRNA usando piattaforme di Array. A tale scopo, abbiamo utilizzato un protocollo ottimizzato da cellule staminali di epiblasto di topo (epiSC) differenziate in neuroni mDA (Jeager et al.,2011). Dall'analisi bioinformatica dei dati dell'array, ottenuti dalle epiSC differenziate in neuroni mDA, abbiamo identificato alcuni candidati molto probabilmente implicati nella differenziazione e nella funzione dei neuroni DA. I miRNA candidati sono stati sottoposti a screening per la loro capacità di indurre il fenotipo DA. A questo scopo, ho generato vettori lentivirali inducibili per ciascun miRNAs e ho infettato colture primarie mesencefaliche di topo allo stadio E12.5. Tra tutti i miRNA candidati, miR-218 e miR-34b/c aumentano il numero di cellule TH + positive, suggerendo il loro possibile contributo nei neuroni mDA. Inoltre, miR-218 e miR-34b/c, risultano arricchiti sia nel mesencefalo dei topi (E13.5) che nelle cellule GFP + sortate al FACS, isolate da embrioni E13.5 Pitx3-GFP di topo, rispetto al controllo. I dati ottenuti dal saggio di Luciferasi e dal saggio di reporter a doppia fluorescenza suggeriscono che miR-34b/c legano e sopprimono la 3'UTR di Wnt1 e viene espresso durante la differenziazione dei neuroni mDA. Tramite analisi di ibridazione in situ e dati d’ immunoistochimica ho potuto verificare che miR-218 è espresso in particolare nel mesencefalo di topo allo stadio E14, dove co-localizza rostralmente con Isl-1 (marcatore di motoneuroni) e caudalmente con TH, Pitx3, Lmx1a (marcatori dopaminergico). Questi dati suggeriscono che miR-218 è espresso anche nei motoneuroni craniali, come descritto in altri recenti studi (Thiebes, K.P. et al., 2014; Amin, N.D et al., 2015). Per comprendere ulteriormente il ruolo di miR-218 nello sviluppo e nella funzione dei neuroni dopaminergici ho generato topi knock-out condizionali (cKO) per miR-218-2. Accoppiando miR-218-2 flox / flox con topi En1Cre /+ che esprimono Cre sotto il controllo del promotore di Engrailed 1 (En1, marker pro-dopaminergico), sarò in grado di comprendere il contributo di miR-218 nel sistema dopaminergico. I topi miR-218-2 flox / flox En1Cre /+ da osservazioni preliminari, hanno mostrato un fenotipo con danno motorio, ma per confermare questi dati sto attualmente effettuando test comportamentali e analisi in vivo. Attraverso il profilo di espressione di miRNAs, siamo in grado di comprendere il meccanismo e la funzione del sistema dopaminergico, poiché i miRNAs sono regolatori chiave nelle reti di espressione genica, possono influenzare molti processi biologici e in futuro potrebbero essere utilizzati come biomarkers per diagnosticare patologie legate al sistema nervoso.
Midbrain dopaminergic neurons (mDA) development is a complex and still not fully understood phenomenon. Many studies till now concentrated their attention on the roles played by several, specific and well-known transcription factors. The aim of my PhD thesis is focus on a relatively new class of post-transcriptional regulators named microRNAs (miRNAs) able to regulate gene expression by targeting partially complementary sequences in the 3’untranslated regions (UTRs) of the target mRNAs. To investigate the role played by miRNAs during mDA differentiation, we choose to analyze miRNAs expression profile by using miRNA Array platforms. To this purpose we used an optimized protocol from mouse Epiblast stem cells (epiSC) differentiated into DA neurons (Jeager et al. 2011). By bioinformatics analysis of the array data, obtained from epiSC differentiated into mDA neurons, we identified few candidates most likely implicated in the DA neurons differentiation and function. The candidate miRNAs were screened for their ability to induce DA phenotype. To this purpose, I generated inducible lentiviral vectors for each miRNA and I have infected mesencephalic primary cultures from mice at stage E12.5. Among all candidate miRNAs, miR-218 and miR-34b/c increase the number of TH+ positive cells, showing their possible contribution in the mDA neurons. Moreover, miR-218 and miR-34b/c, were enriched both in midbrain of mice (E13.5) and in FACS sorted GFP+ cells isolated from E13.5 Pitx3-GFP mice embryos when compared with control. Data obtained from Luciferase Assay and Dual Fluorescence Reporter Assay suggest that miR-34b/c target and suppress Wnt1 3’UTR and it is expressed during DA neurons differentiation. By performing In situ hybridization analysis and immunohistochemistry, I was able to detect miR-218 in particular in the mouse midbrain at stage E14, where co-localize rostrally with Isl-1 (motor neuron marker) and caudally with TH, Pitx3, Lmx1a (dopaminergic marker). This data suggests that miR-218 is expressed also in cranial motor neurons, as described in others recent studies (Thiebes, K.P. et al. 2014; Amin, N.D et al. 2015). To further understand the role of miR-218 in development and function of dopaminergic neurons I have generated the conditional knock-out (cKO) mice for miR-218-2. By mating miR-218-2 flox/flox with En1Cre/+ mice expressing the Cre under Engrailed 1 promoter (En1 is a pro-dopaminergic marker) I will be able to investigate the contribution of miR-218 in dopaminergic system. Preliminary observations on miR-218-2 flox/flox En1Cre/+ mice shown motor impairment phenotype, but to confirm this data I’m currently performing behavior tests and in vivo analysis. Through miRNA expression profiling we be able understand mechanism and function of dopaminergic system, because miRNAs are as key regulators in gene expression networks, can influence many biological processes and have also shown promise as biomarkers for neuro-disorders.
microRNAs; dopaminergic neurons; miRNAs espression; neurodisorders
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