Epileptic encephalopathies represent a heterogeneous group of early onset and childhood disorders characterized by severe, intractable seizures, specific electroencephalographic (EEG) signatures, and different levels of developmental delay or regression, often with a poor prognosis. Advances in genomic analysis in the last 10 years have identified novel genes and variants in a large fraction of affected children, often defining novel clinical entities. Mutations in several potassium channels have been found in a variety of developmental and epileptic encephalopathies. KCNT1 (Slo2.2 or Slack), together with KCNT2 (Slo2.1 or Slick), belongs to the SLO2 family of Na+-dependent K+ channel genes, encoding for pore-forming α-subunits variably gated by changes in voltage and/or concentrations of intracellular ions or second messengers. In the present Doctoral Thesis, I have investigated the biochemical, functional and pharmacological consequences of de novo, heterozygous KCNT1 mutations (G288S, M516V, E893K and R950Q) found in patients affected by Malignant Migrating Partial Seizures in Infancy (MMPSI), a severe early-onset epileptic encephalopathy characterized by pharmacoresistant focal seizures migrating from one brain region or hemisphere to another. I have also studied on a recent, parallel investigation the effects prompted by two de novo variants in KCNT2 gene (R190H and R190P) as well as the effects of the inherited C484Y variant found in a patient with Autosomal Dominant Nocturnal Frontal Lobe Epilepsy (ADNFLE). The results obtained indicate that (except for the KCNT2-C484Y variant, whose functional properties are indistinguishable from those of wild-type channels) all KCNT1 and KCNT2 mutations herein investigated, induced a significant increase in current densities as well as a leftward shift of the voltage-dependence of activation compared to wild-type channels. Notably, the KCNT-blocker quinidine induced a concentration-dependent block of currents elicited by KCNT1 and KCNT2 channels, with mutant channels showing a higher sensitivity to the drug when compared to the corresponding wild-type subunits. Overall, the results obtained suggest a gain-of-function pathogenetic mechanism responsible for both KCNT1- and KCNT2-related disorders, thus highlighting treatment opportunities with K+ channel blockers such as quinidine as targeted therapies in these individuals.

Le encefalopatie epilettiche costituiscono un vasto ed eterogeneo gruppo di patologie neuronali caratterizzate da convulsioni farmacoresistenti, anomalie elettroencefalografiche tipiche e ritardo/regressione dello sviluppo neurognitivo, molto spesso con prognosi sfavorevole. I progressi ottenuti negli ultimi dieci anni nell’ambito dell’analisi genomica hanno permesso di identificare nuovi geni coinvolti nella patogenesi della malattia e nuove varianti geniche coinvolte in una grande percentuale di bambini affetti, definendo così nuove entità cliniche. Mutazioni in diversi geni che codificano per canali del K+ sono state riscontrate in diverse encefalopatie epilettiche e disordini dello sviluppo. I canali KCNT1 (chiamati anche SLO2.2 o Slack), insieme ai canali KCNT2 (denominati anche SLO2.2 o Slick), appartengono alla famiglia dei canali del K+ Na-dipendenti SLO2. Tali geni codificano per subunità di tipo alfa, la cui apertura è dipendente in maniera variabile dai cambiamenti del voltaggio di membrana e/o dalle concentrazioni di ioni intracellulari o secondi messaggeri. Nel presente lavoro di Dottorato, mediante un approccio di tipo biochimico, funzionale e farmacologico, sono stati studiati gli effetti indotti dalla presenza delle mutazioni G288S, M516V, E893K e R950Q localizzate nel gene KCNT1 e riscontrate in pazienti affetti da Convulsioni Infantili Maligne Migranti di tipo Parziale (MMPSI). Tale disordine neuronale, è una encefalopatia epilettica che si caratterizza per una marcata farmacoresistenza, con crisi focali in grado di migrare da una regione cerebrale o emisfero ad un’altra. Inoltre, sono stati studiati gli effetti indotti dalla presenza di due mutazioni de novo nel gene KCNT2 (R190H e R190P), il cui ruolo in letteratura non è noto essere associato ad alcuna patologia. Infine, sono stati studiati gli effetti indotti dalla presenza della variante genica KCNT2-C484Y riscontrata in un caso di Epilessia Notturna del Lobo Frontale di tipo Autosomico Dominante. I risultati ottenuti rivelano che tutte le varianti trovate nei geni KCNT1 e KCNT2 (eccetto per la variante KCNT2-C484Y le cui proprietà funzionali non sono diverse da quelle del canale KCNT2 wild-type) determinano un significativo aumento della densità di corrente ed uno spostamento a sinistra della voltaggio-dipendenza del canale quando confrontati con il canale wild-type. Al fine di revertire gli effetti indotti dalla presenza di ciascuna mutazione in studio nei geni KCNT1 e KCNT2, nel presente lavoro è stato testato un noto bloccante dei canali KCNT, la chinidina, a diverse concentrazioni. Quando la chinidina veniva perfusa sul canale KCNT1 o KCNT2 wild-type o incorporante ciascuna mutazione in studio, si osservava un effetto di blocco dose-dipendente e una maggiore sensibilità al blocco indotto dal farmaco sui canali incorporanti ciascuna mutazione in studio se confrontati con il rispettivo canale wild-type. In conclusione, questi risultati suggeriscono che il guadagno di funzione indotto dalla presenza di ciascuna mutazione in studio costituisce un meccanismo patogenetico nei disordini correlati ai geni KCNT1 e KCNT2. Inoltre, questi risultati evidenziano che l’utilizzo di bloccanti dei canali del K+ come la chinidina costituisce una nuova opportunità terapeutica mirata per il trattamento di questi pazienti.

Genetic, pathophysiological, and pharmacological implications of KCNT1 and KCNT2 potassium channels in neurodevelopmental disorders and epileptic encephalopathies

Manocchio, Laura
2018-03-20

Abstract

Le encefalopatie epilettiche costituiscono un vasto ed eterogeneo gruppo di patologie neuronali caratterizzate da convulsioni farmacoresistenti, anomalie elettroencefalografiche tipiche e ritardo/regressione dello sviluppo neurognitivo, molto spesso con prognosi sfavorevole. I progressi ottenuti negli ultimi dieci anni nell’ambito dell’analisi genomica hanno permesso di identificare nuovi geni coinvolti nella patogenesi della malattia e nuove varianti geniche coinvolte in una grande percentuale di bambini affetti, definendo così nuove entità cliniche. Mutazioni in diversi geni che codificano per canali del K+ sono state riscontrate in diverse encefalopatie epilettiche e disordini dello sviluppo. I canali KCNT1 (chiamati anche SLO2.2 o Slack), insieme ai canali KCNT2 (denominati anche SLO2.2 o Slick), appartengono alla famiglia dei canali del K+ Na-dipendenti SLO2. Tali geni codificano per subunità di tipo alfa, la cui apertura è dipendente in maniera variabile dai cambiamenti del voltaggio di membrana e/o dalle concentrazioni di ioni intracellulari o secondi messaggeri. Nel presente lavoro di Dottorato, mediante un approccio di tipo biochimico, funzionale e farmacologico, sono stati studiati gli effetti indotti dalla presenza delle mutazioni G288S, M516V, E893K e R950Q localizzate nel gene KCNT1 e riscontrate in pazienti affetti da Convulsioni Infantili Maligne Migranti di tipo Parziale (MMPSI). Tale disordine neuronale, è una encefalopatia epilettica che si caratterizza per una marcata farmacoresistenza, con crisi focali in grado di migrare da una regione cerebrale o emisfero ad un’altra. Inoltre, sono stati studiati gli effetti indotti dalla presenza di due mutazioni de novo nel gene KCNT2 (R190H e R190P), il cui ruolo in letteratura non è noto essere associato ad alcuna patologia. Infine, sono stati studiati gli effetti indotti dalla presenza della variante genica KCNT2-C484Y riscontrata in un caso di Epilessia Notturna del Lobo Frontale di tipo Autosomico Dominante. I risultati ottenuti rivelano che tutte le varianti trovate nei geni KCNT1 e KCNT2 (eccetto per la variante KCNT2-C484Y le cui proprietà funzionali non sono diverse da quelle del canale KCNT2 wild-type) determinano un significativo aumento della densità di corrente ed uno spostamento a sinistra della voltaggio-dipendenza del canale quando confrontati con il canale wild-type. Al fine di revertire gli effetti indotti dalla presenza di ciascuna mutazione in studio nei geni KCNT1 e KCNT2, nel presente lavoro è stato testato un noto bloccante dei canali KCNT, la chinidina, a diverse concentrazioni. Quando la chinidina veniva perfusa sul canale KCNT1 o KCNT2 wild-type o incorporante ciascuna mutazione in studio, si osservava un effetto di blocco dose-dipendente e una maggiore sensibilità al blocco indotto dal farmaco sui canali incorporanti ciascuna mutazione in studio se confrontati con il rispettivo canale wild-type. In conclusione, questi risultati suggeriscono che il guadagno di funzione indotto dalla presenza di ciascuna mutazione in studio costituisce un meccanismo patogenetico nei disordini correlati ai geni KCNT1 e KCNT2. Inoltre, questi risultati evidenziano che l’utilizzo di bloccanti dei canali del K+ come la chinidina costituisce una nuova opportunità terapeutica mirata per il trattamento di questi pazienti.
Implicazioni genetiche, patofisiologiche e farmacologiche dei canali del potassio KCNT1 e KCNT2 nei disordini dello sviluppo neurocognitivo e nelle encefalopatie epilettiche
Epileptic encephalopathies represent a heterogeneous group of early onset and childhood disorders characterized by severe, intractable seizures, specific electroencephalographic (EEG) signatures, and different levels of developmental delay or regression, often with a poor prognosis. Advances in genomic analysis in the last 10 years have identified novel genes and variants in a large fraction of affected children, often defining novel clinical entities. Mutations in several potassium channels have been found in a variety of developmental and epileptic encephalopathies. KCNT1 (Slo2.2 or Slack), together with KCNT2 (Slo2.1 or Slick), belongs to the SLO2 family of Na+-dependent K+ channel genes, encoding for pore-forming α-subunits variably gated by changes in voltage and/or concentrations of intracellular ions or second messengers. In the present Doctoral Thesis, I have investigated the biochemical, functional and pharmacological consequences of de novo, heterozygous KCNT1 mutations (G288S, M516V, E893K and R950Q) found in patients affected by Malignant Migrating Partial Seizures in Infancy (MMPSI), a severe early-onset epileptic encephalopathy characterized by pharmacoresistant focal seizures migrating from one brain region or hemisphere to another. I have also studied on a recent, parallel investigation the effects prompted by two de novo variants in KCNT2 gene (R190H and R190P) as well as the effects of the inherited C484Y variant found in a patient with Autosomal Dominant Nocturnal Frontal Lobe Epilepsy (ADNFLE). The results obtained indicate that (except for the KCNT2-C484Y variant, whose functional properties are indistinguishable from those of wild-type channels) all KCNT1 and KCNT2 mutations herein investigated, induced a significant increase in current densities as well as a leftward shift of the voltage-dependence of activation compared to wild-type channels. Notably, the KCNT-blocker quinidine induced a concentration-dependent block of currents elicited by KCNT1 and KCNT2 channels, with mutant channels showing a higher sensitivity to the drug when compared to the corresponding wild-type subunits. Overall, the results obtained suggest a gain-of-function pathogenetic mechanism responsible for both KCNT1- and KCNT2-related disorders, thus highlighting treatment opportunities with K+ channel blockers such as quinidine as targeted therapies in these individuals.
epilepsy; KCNT1; KCNT2; quinidine
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