New insights into the biology and ecology of the insect vectors of apple proliferation for the development of sustainable control strategies

Phytoplasmas are pleomorphic wall-less prokaryotes related to bacteria belonging to the Mollicutes class and are characterized by a very small genome. The lack of essential biosynthetic pathways makes them obligate parasites of plants and insect vectors. In plants, these pathogens are restricted to the phloem tissue and cause symptoms suggesting profound disorders in the normal balance of hormones. In insects, their effects on fitness can range from detrimental to beneficial, depending on the evolutionary relationships. Phytoplasmas are associated with diseases of hundreds of plant species worldwide, including many economically important crops, fruit trees, and ornamental plants. Insect vectors represent the principal means of phytoplasma transmission and interactions between phytoplasmas and insect hosts are, in some cases, very specific and involve a complex sequence of events. Only phloem-feeding insects like leafhoppers, planthoppers, and psyllids can potentially acquire and transmit these obligate parasites. ‘Candidatus Phytoplasma mali’ is the etiological agent of Apple proliferation (AP) disease, which represents one of the most severe problems in European apple orchards. In Trentino, one of the main apple producing regions in Italy, AP is the major threat for the production. The main symptoms are witches’ brooms, enlarged stipules, and early leaf reddening in autumn. The fruits of infected trees, which are smaller and have altered organoleptic properties, cannot be commercialized. So far, two psyllid species, Cacospylla picta and Cacopsylla melanoneura (Homoptera: Psyllidae), are confirmed vectors, but their actual role in the epidemiology of AP is still debated, as studies conducted in different geographical regions show different transmission efficiencies. This research is part of a project launched in Trentino after a serious outbreak of the disease reported in Valsugana (southeastern Trentino) in 2011. The main objectives of this work regarded the study of epidemiological traits of the disease and biological features of the insect vectors. The first aim was monitoring the disease spread and vector populations’ dynamics, evaluating the natural infection level of psyllids and some transmission parameters, such as acquisition capacity, transmission efficiency, and the possibility of a transovarial phytoplasma transmission. The distribution of infected plants was mapped along Valsugana and the populations of the psyllid vectors were monitored in the period 2014-2016. After a three-year survey, the percentage of symptomatic apple plants drastically decreased. Regarding the psyllid vectors, C. melanoneura showed higher population levels compared to C. picta in both conventional and untreated orchards, but the percentages of infected individuals were higher in the latter species. The transmission parameters were evaluated in psyllids during acquisition and transmission trials carried out with C. picta and C. melanoneura. Specific trials were conducted with C. picta to assess the vertical transmission of the phytoplasma. Experiments, conducted under semi-field and greenhouse conditions in spring and summer 2015 and 2016, involved overwintered adults of both species collected in Valsugana and nymphs and emigrant adults reared on infected apple plants. After each experiment, insects and test plants were analyzed by real-time PCR to assess the phytoplasma presence. Results confirm C. picta as a more competent ‘Ca. P. mali’ vector in Trentino, but suggest the possibility of acquiring and transmitting the phytoplasma also for C. melanoneura, even though with a low efficiency. For both species, overwintered adults were able to transmit the disease only after an acquisition period spent on infected plants and the acquiring capacity of the stages developed on infected apple plants was very high. Moreover, for the first time was demonstrated that infected C. picta individuals are able to transmit ‘Ca. P. mali’ to the progeny. Another goal of this research was to unravel the tri-trophic relationship involving phytoplasma and its hosts by the study of the genetic diversity of phytoplasma isolates in plants and insect vectors and their geographical distribution. So, a genetic characterization of phytoplasma was conducted, and isolates obtained from insects and apple plants collected in different geographical areas were analyzed by a multilocus sequence typing method based on four phytoplasma genes. The results obtained are only partial, but the different ‘Ca. P. mali’ genotypes observed so far indicate a higher genetic diversity in insects compared to host plants and suggest the hypothesis of specific relationships between phytoplasma genotypes and insect vectors. New insights on psyllid ethology were achieved. In particular, a research was conducted to investigate the vibrational communication involved in reproductive behavior. For the two vector species, ethological observations and laser vibrometer recordings of the vibrational signals emitted during courtship were carried out. Signals appeared to be species-specific, but they did not seem to be a prerequisite for courtship and mating. Moreover, as already seen in other psyllid species, a scanning electron microscopy investigation showed the presence of a stridulatory mechanism on thorax and wings of both species. Finally, as other homopteran species are known to be phytoplasma vectors, a goal of this research was to look for potential new vectors of AP phytoplasma, characterizing the leafhoppers’ and planthoppers’ communities in apple orchards of Valsugana and studying the effect of surrounding landscapes on their distribution. Samplings were conducted in apple orchards surrounded by different landscapes and in different habitats inside the orchard. The results of this study indicate that landscapes influence the species richness and, regarding habitats, that grasses are visited by higher numbers of species and individuals in all landscapes considered. All insect collected were tested by real-time PCR and results indicate that three samples belonging to three different species tested positive to ‘Ca. P. mali’. Research conducted in this thesis drew a picture of AP disease spread in Valsugana. Results obtained in all the topics described above, from epidemiological studies to phytoplasma genetic variability, passing through vectors’ courtship behavior and agroecosystem biodiversity, represent the theoretical background that helps advisors and growers to optimize the current disease management, and researchers to develop innovative and sustainable control strategies.

I fitoplasmi sono procarioti pleomorfi, privi di parete cellulare, simili a batteri ed appartenenti alla classe Mollicutes e sono caratterizzati da un genoma molto ridotto. L’assenza di vie metaboliche essenziali li rende parassiti obbligati di piante ed insetti. Nelle prime, la presenza di questi patogeni è limitata ai tessuti floematici e causa sintomi associati a profondi disordini nel normale bilancio ormonale. Negli insetti, gli effetti dei fitoplasmi sulla fitness sono vari e, a seconda delle relazioni evolutive, possono essere deleteri o benefici. I fitoplasmi sono associati a centinaia di patologie di specie vegetali distribuite in tutto il mondo, comprese colture di elevate importanza economica, fruttiferi e anche piante ornamentali. Il principale mezzo di trasmissione di questi patogeni è costituito da insetti vettori e le interazioni tra fitoplasmi ed insetti sono, in alcuni casi, molto specifiche e coinvolgono una complessa catena di eventi. Solo fitomizi floematici, come cicadomorfi, fulgoromorfi e psille hanno il potenziale per acquisire e trasmettere questi parassiti obbligati. ‘Candidatus Phytoplasma mali’ è l’agente eziologico di Apple proliferation (AP), una malattina che rappresenta uno dei più gravi problemi nei meleti europei. In Trentino, una delle principali regioni produttrici di mele in Italia, AP è una minaccia per la produzione. I sintomi più evidenti sono la presenza di scopazzi sui rami, di stipole ingrandite nelle foglie e di arrossamenti anticipati delle chiome in autunno. I frutti degli alberi infetti, che hanno dimensioni inferiori e proprietà organolettiche alterate, non possono essere commercializzati. Finora due psille, Cacospylla picta e Cacopsylla melanoneura (Homoptera: Psyllidae), sono state confermate vettori della malattia, ma il loro reale ruolo nell’epidemiologia di AP è ancora oggetto di discussione, dal momento che studi condotti in aree geografiche diverse mostrano efficienze di trasmissione differenti. Questa ricerca si inserisce all’interno di un progetto avviato in Trentino dopo che un’esplosione della fitoplasmosi è stata segnalata in Valsugana (Trentino sud-orientale) nel 2011. I principali obiettivi di questa ricerca hanno riguardato lo studio di alcuni aspetti dell’epidemiologia di AP alcune caratteristiche biologiche degli insetti vettori. Il primo scopo è stato quello di monitorare l’avanzamento della malattia e le dinamiche di popolazione dei vettori, valutando le percentuali di infezione naturale delle psille e alcuni parametri relativi al processo di trasmissione, come la capacità di acquisizione, l’efficienza di trasmissione e la possibilità di trasmissione transovarica del fitoplasma. La distribuzione delle piante infette è stata mappata lungo la Valsugana e le popolazioni delle psille vettrici sono state monitorate tra il 2014 e il 2016. Dopo tre anni di rilievi, si è ottenuta una drastica diminuzione della percentuale di piante sintomatiche. Riguardo gli insetti vettori, C. melanoneura si è rivelata essere la specie con densità di popolazione più elevate sia in frutteti coltivati, sia in frutteti abbandonati, ma la specie con percentuali di infettività maggiori è risultata essere C. picta. I parametri di trasmissione per entrambe le specie di psilla sono stati valutati attraverso prove di acquisizione e trasmissione e prove specifiche sono state condotte per verificare se vi è trasmissione transovarica del fitoplasma in C. picta. Gli esperimenti condotti in condizioni di semi-campo e serra, durante la primavera e l’estate del 2015 e del 2016, hanno riguardato adulti svernanti di entrambe le specie (campionati in Valsugana) e ninfe e adulti di nuova generazione allevati su piante di melo infette. Alla fine di ogni esperimento, piante e insetti sono stati analizzati tramite real-time PCR per verificare la presenza di fitoplasma. I risultati confermano che C. picta è un vettore molto più efficiente in Trentino, ma suggeriscono la possibilità di acquisizione e trasmissione del fitoplamsa anche in C. melanoneura, anche se con una bassa efficienza. Per entrambe le specie, gli adulti svernanti sono stati in grado di trasmettere il fitoplasma solo dopo aver trascorso un periodo di acquisizione su piante infette e la capacità di acquisizione degli stadi che si sono sviluppati su piante infette è stata molto elevata. In più, è stata dimostrato per la prima volta che individui infetti di C. picta sono capaci di trasmettere ‘Ca. P. mali’ alla progenie. Uno degli obiettivi di questa ricerca era lo studio del rapporto tritrofico tra fitoplasma e i suoi ospiti, attraverso indagini sulla diversità genetica del fitoplasma in piante e insetti vettori e sulla loro distribuzione geografica. Quindi il fitoplasma è stato caratterizzato geneticamente e gli isolati ottenuti da piante di melo e insetti raccolti in differenti aree geografiche sono stati analizzati attraverso un metodo di multilocus sequencing typing basato su quattro geni del fitoplasma. I risultati ottenuti sono solo parziali, ma i differenti genotipi di ‘Ca. P. mali’ ottenuti finora indicano la presenza di un’elevata variabilità genetica negli insetti rispetto alle piante, che suggerisce l’ipotesi dell’esistenza di relazioni specifiche tra genotipi di fitoplasma e insetti vettori. Nuove informazioni sono state ottenute sull’etologia delle psille, in particolare per quanto riguarda il comportamento riproduttivo. Per questo, sono state condotte osservazioni etologiche e registrazioni dei segnali vibrazionali emessi durante il corteggiamento attraverso l’uso di un laser vibrometro. Il segnale sembra essere specie-specifico, ma non sembra essere un prerequisito per il corteggiamento e l’accoppiamento. Inoltre, come già visto in altri psillidi, indagini al microscopio elettronico a scansione hanno evidenziato la presenza di strutture stridulatorie su torace e ali di entrambe le specie. Infine, poiché è noto che altre specie di omotteri sono vettori di fitoplasmosi, un obiettivo di questo studio è stato la ricerca di potenziali nuovi vettori di ‘Ca. P. mali’, caratterizzando allo stesso tempo le comunità di cicadomorfi e fulgoromorfi dei meleti della Valsugana e valutando l’effetto dei paesaggi circostanti sulla loro distribuzione. I campionamento sono stati condotti in meleti circondati da diversi paesaggi e anche all’interno di diversi habitat nello stesso meleto. I risultati di questo studio indicano che i paesaggi influenzano la ricchezza in specie e che, riguardo gli habitat, il cotico erboso del frutteto è visitato da numeri più elevati di specie e individui in tutti i paesaggi considerati. Tutti gli individui raccolti sono stati analizzati tramite real-time PCR e i risultati indicano che almeno due specie di cicaline sono state capaci di acquisire ‘Ca. P. mali’. Le ricerche condotte in questa tesi hanno permesso di tracciare un quadro diffusione di AP in Valsugana. I risultati ottenuti nei diversi ambiti di ricerca descritti sopra, dagli studi epidemiologici e di variabilità genetica, passando attraverso il comportamento sessuale dei vettori e la biodiversità nell’agroecosistema, rappresentano le basi teoriche per aiutare consulenti tecnici e agricoltori ad ottimizzare l’attuale gestione della malattia e i ricercatori a sviluppare strategie di controllo innovative e sostenibili.