Medicago marina (L.) seed: unravelling mechanisms controlling germination and dormancy

L’obiettivo generale di questo lavoro di tesi è studiare i complessi e poco conosciuti meccanismi che regolano la dormienza e la germinazione del seme di Medicago marina (L.), una specie mediterranea presente sulle coste dell’intera penisola italiana e che si è adattata a vivere in habitat specializzati come le dune. I semi di questa specie sono caratterizzati da una forte dormienza che ne impedisce la germinazione e i risultati ottenuti durante il primo periodo del corso di dottorato, sono stati recentemente pubblicati (Scippa et al., 2011). I meccanismi che regolano dormienza/germinazione e la risposta agli stress dei semi di questa specie, sono stati studiati attraverso analisi fisiologiche e di proteomica. Fra i pretrattamenti utilizzati (scarificazione meccanica, congelamento a -20°C e riscaldamento a 100°C per un’ora), la scarificazione e il congelamento sono stati più efficaci nella rimozione della condizione di dormienza. Il ruolo dell’acido abscissico (ABA) è stato studiato attraverso un dosaggio immunoenzimatico (ELISA) che ha permesso di determinarne la concentrazione nei semi trattati, germinati e non germinati (semi maturi utilizzati come controllo). Fra tutti, la maggiore concentrazione di ABA è stata riscontrata nei semi sottoposti a riscaldamento, mentre il confronto fra la concentrazione di ABA raggiunta nei campioni germinati, di controllo e trattati ha fatto supporre che, nel seme, si attivino diverse vie di segnalazione in grado di regolare da un lato l’omeostasi dell’ABA in risposta a diverse condizioni di stress e dall’altro la germinazione. L’analisi del proteoma ha rivelato la presenza di 46 proteine espresse in maniera differenziale fra i campioni trattati e il controllo, di cui 14 sono state sequenziale e identificate attraverso spettrometria di massa. Diverse, fra le proteine identificate, sono importanti fattori di risposta a situazioni di stress, essendo coinvolte nel metabolismo dei lipidi, nel folding proteico e nella protezione della cromatina. L’analisi del fosfoproteoma ha dimostrato che la funzione di molte proteine, soprattutto nei semi sottoposti a riscaldamento, è modulata attraverso modificazioni post-traduzionali. Questi risultati lasciano presupporre che i semi di M. marina adottano una strategia di dormienza basata sulla presenza di robusti tegumenti (hardseededness) in grado di prevenire l’assorbimento di acqua e la germinazione; inoltre la dormienza può essere regolata da altri complessi meccanismi fisiologici, quali la termoinibizione. Da questi primi risultati, si è portato avanti lo studio volto a definire il ruolo di controllo della dormienza e della germinazione da parte dell’endosperma micropilare. A questo scopo, utilizzando la tecnica del puncture force, è stato misurato il weakening dell’endosperma micropilare nei semi sottoposti a scarificazione meccanica e a trattamento con ABA durante un time course di circa 22 ore. L’effetto dell’ABA è stato valutato anche sulla velocità e sul tasso di germinabilità finale dei semi sottoposti a tale trattamento. I risultati ottenuti hanno dimostrato che l’ABA è in grado di provocare un ritardo sia del weakening dell’endosperma sia della velocità di germinazione, che si traduce a sua volta in una considerevole diminuzione della percentuale di germinazione finale. In seguito, attraverso l’analisi del proteoma e l’analisi statistica multivariata sono state individuate 95 proteine che potrebbero rappresentare markers specifici dei diversi stati fisiologici, quando, superata la fase di dormienza il seme si prepara per la germinazione. Risultati preliminari suggeriscono che l’endosperma micropilare può contribuire all’instaurarsi della condizione di dormienza fisica che, ancora una volta, può essere rimossa efficacemente attraverso la scarificazione meccanica; inoltre l’ABA può svolgere un ruolo predominante nella regolazione temporale della geminazione, agendo sul weakening dell’endosperma micropilare.