Approcci molecolari per la comprensione dei meccanismi genetici della degradazione della patulina da parte dell’agente di biocontrollo Rhodosporidium kratochvilovae ceppo LS11 e da parte del ceppo IAM 13481 di Sporobolomyces sp.

La Patulina è una micotossina prodotta dal patogeno postraccolta Penicillium expansum. Contamina frutti di pomacee e prodotti derivati rappresentando un rischio per la salute dei consumatori. L’agente di biocontrollo Rhodosporidium kratochvilovae LS11 (lievito basidiomicete precedentemente classificato come Rhodotorula glutinis) è in grado di prevenire le infezioni di P. expansum e di metabolizzare in vitro, in condizioni di aerobiosi, la patulina. Il processo di degradazione porta alla formazione di acido desossipatulinico (DPA), composto caratterizzato da tossicità molto inferiore a quella della micotossina. Allo scopo di identificare i geni coinvolti nella degradazione della patulina, sono stati prodotti dei putativi mutanti inserzionali di R. kratochvilovae LS11 mediante trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens (AMT). Tuttavia, le analisi genetico-molecolari condotte dimostrano la mancata trasformazione di questo lievito. Perciò, mediante AMT sono stati prodotti putativi mutanti inserzionali del ceppo di riferimento del genere Sporobolomyces, Sporobolomyces sp. IAM 13481. Questo lievito utilizza lo stesso pathway degradativo di LS11, formando DPA come prodotto finale della degradazione della patulina. La generazione di mutanti inserzionali di Sporobolomyces sp. IAM 13481 è stata condotta utilizzando un sistema di selezione basato sull’auxotrofia per l’uracile sviluppato in questo studio. 3200 trasformanti sono stati esaminati per la loro capacità di degradare la patulina mediante un biosaggio ad alta efficienza basato sulla differente tossicità di patulina e DPA nei confronti di Escherichia coli DH5α. Le successive analisi cromatografiche hanno mostrato che 15 trasformanti degradano la micotossina più lentamente del ceppo wild type Sporobolomyces sp. IAM 13481, e sono perciò stati denominati slower patulin degraders. Il ruolo dei geni disattivati dalle inserzioni di T-DNA nella degradazione della patulina è stato individuato correlando i meccanismi della tossicità della micotossina e la risposta fenotipica dei mutanti inserzionali slower patulin degraders. Il fenotipo slower patulin degrader appare dovuto alla disattivazione di geni coinvolti nella resistenza alla patulina, come nel caso di geni implicati più o meno direttamente nella resistenza allo stress ossidativo e nel mantenimento dell’integrità della membrana plasmatica e/o della parete cellulare (CYB5, YCK2, PAC2, ECM38, gene che codifica per la proteina con ID 28891, CDC24, GYP7, VPS8, SSO1 e MCM1). I dati ottenuti suggeriscono che, oltre ai geni codificanti per enzimi che catalizzano gli step del pathway degradativo della patulina e hanno perciò un ruolo diretto nella sua degradazione, altri geni, come quelli identificati in questo studio, esplicano un ruolo indiretto che permette alle cellule di Sporobolomyces sp. IAM 13481 di resistere inizialmente all’azione tossica della micotossina, presumibilmente propedeutico al processo degradativo. Per confermare il fenotipo ottenuto in seguito all’inattivazione di VPS8 causata dall’inserzione del T-DNA, sono stati creati, mediante mutagenesi mirata (gene replacement), mutanti delezionali di questo gene. Diversamente da quanto atteso, i due mutanti vps8 generati con mutagenesi inserzionale random (AMT) e mutagenesi mirata mostrano una risposta fenotipica differente. Questo potrebbe essere dovuto a riarrangiamenti del T-DNA che interferiscono anche con l’espressione di altri geni. Il pathway di degradazione della patulina è stato recentemente caratterizzato. Il primo step della degradazione consiste nell’idrolisi enzimatica dell’anello lattonico della micotossina. Quindi sono stati condotti esperimenti di gene replacement a carico dei geni DLH e rDLH di Sporobolomyces sp. 13481 che codificano per due diverse diene lattone idrolasi. I dati preliminari ottenuti suggeriscono un diretto coinvolgimento di questi geni nel processo di degradazione.