The role of sialic acid in the biological activity of bovine lactoferrin

Bovine Lactoferrin (bLf) is a glycoprotein with pleiotropic pharmacological effects, whose biological activity is influenced by several physicochemical features, including conformation, charge, iron saturation, and glycosylation. Among glycan components, terminal sialic acids (Sia) are structurally and functionally relevant, but their specific contribution to the canonical biological functions of bLf remains poorly understood. This research investigated the functional role of Sia in the antioxidant, iron-regulatory, immunomodulatory, and anti-cancer functions of bLf by comparing a highly sialylated native form (n-bLf) with its enzymatically desialylated derivative (d-bLf). Biochemical characterization demonstrated that Sia removal does not affect protein integrity, conformation, thermal stability, iron-binding capacity, cellular uptake, or nuclear localization, although it increased susceptibility to proteolytic degradation. Functional studies revealed that sialylation plays a significant role in the biological efficacy of bLf. While d-bLf retained partial activity, it displayed reduced antioxidant and anti-inflammatory effects compared with n-bLf. In cellular models of oxidative stress, n-bLf efficiently protected cells from H₂O₂-induced damage, reduced oxidative damage markers, and modulated key antioxidant systems, including System Xc⁻, glutamate-cysteine ligase, and superoxide dismutase. In addition, n-bLf preserved iron homeostasis by sustaining iron-related proteins such as ferroportin, ferritin, and transferrin receptor, whereas the desialylated form showed a weaker regulatory capacity. The immunomodulatory properties of bLf were also influenced by sialylation. In THP-1-derived macrophages, n-bLf maintained a controlled immunomodulatory profile, whereas d-bLf induced increased cytokine production. Under inflammatory stimulation with LPS and IFN-γ, n-bLf significantly reduced the expression of pro-inflammatory cytokines, including IL-6, IL-1β, and TNF-α, while the desialylated form showed diminished anti-inflammatory efficacy. Interestingly, as demonstrated by EMSA, these reduced activities correlated with a two-fold lower DNA-binding affinity of d-bLf compared with the native protein which may underlie its impaired transcriptional regulatory capacity. The second part of the study investigated the role of sialylation in the antitumor activity of bLf using human glioblastoma cell lines. Native bLf inhibited tumor cell proliferation and migration, whereas d-bLf retained these effects with reduced efficiency. Importantly, desialylation did not impair cellular uptake, indicating that reduced activity is likely due to altered intracellular signaling. Furthermore, pharmacological reduction of tumor cell surface sialylation attenuated the antiproliferative and antimigratory effects of bLf and decreased its internalization. Overall, this work reveals a dual and complementary role of sialylation in bLf biological activity. Sialylation of the protein enhances its intracellular regulatory functions, while sialylation of tumor cells facilitates bLf recognition, thus potentiating its anti-tumoral activity. These findings identify sialic acids as key determinants of bLf multifunctionality and highlight glycosylation as an essential parameter in the development and therapeutic application of lactoferrin-based strategies.

L’attività biologica della lattoferrina bovina (bLf), glicoproteina dell’immunità innata, è influenzata da diverse proprietà chimico-fisiche, tra cui la conformazione, la carica, il grado di saturazione in ferro e il pattern di glicosilazione. Tra le componenti glicaniche, l’acido sialico terminale (Sia) riveste un ruolo strutturale e funzionale rilevante, ma non è ancora chiaro il suo contributo alle funzioni biologiche della bLf. Pertanto, lo scopo di questo lavoro è stato quello di valutare il ruolo del Sia nelle principali attività biologiche della Lf, confrontando la forma nativa sialilata (n-bLf) con un suo derivato desialilato ottenuto per via enzimatica (d-bLf). La caratterizzazione biochimica ha evidenziato che la desialilazione non compromette l’integrità della proteina né ne altera la conformazione, la stabilità termica, la capacità di legare il ferro, l’uptake cellulare o la localizzazione nucleare; tuttavia, riduce la resistenza alla degradazione proteolitica. Dagli studi funzionali è emerso che la sialilazione della bLf contribuisce alle sue funzioni biologiche. Sebbene la d-bLf conservi una parziale attività, mostra effetti antiossidanti e anti-infiammatori ridotti rispetto alla n-bLf. Quest’ultima, in modelli cellulari di stress ossidativo, ha protetto le cellule dal danno indotto da H₂O₂, ridotto i marcatori di danno ossidativo e modulato sistemi antiossidanti chiave. Inoltre, la n-bLf ha contrastato la disregolazione del ferro sostenendo l’espressione di proteine chiave, quali ferroportina, ferritina e il recettore della transferrina, mentre d-bLf ha mostrato una capacità regolatoria inferiore. Anche le proprietà immunomodulatorie sono influenzate dalla sialilazione. Nei macrofagi, la n-bLf ha mostrato un profilo immunomodulatorio controllato, mentre la d-bLf ha indotto un aumento della produzione di citochine. In condizioni di stimolazione infiammatoria, la n-bLf ha ridotto la produzione di citochine pro-infiammatorie, mentre la forma desialilata ha mostrato un’attività anti-infiammatoria ridotta. Come dimostrato mediante EMSA, queste ridotte attività risultano correlate a una minore affinità di legame al DNA della d-bLf rispetto alla forma nativa, il che potrebbe indurre una ridotta capacità di regolazione trascrizionale. La seconda parte dello studio ha analizzato il ruolo della sialilazione nell’attività antitumorale della bLf in linee cellulari di glioblastoma umano. La n-bLf ha inibito la proliferazione e la migrazione delle cellule tumorali, mentre la d-bLf è risultata meno efficace, probabilmente per la minore affinità di legame al DNA. La riduzione farmacologica della sialilazione sulla superficie delle cellule tumorali ha attenuato gli effetti antiproliferativi e antimigratori della n-bLf e ne ha ridotto l’internalizzazione, suggerendo che la presenza di strutture sialilate nel glicocalice delle cellule tumorali favorisca il riconoscimento della proteina e ne potenzi, di conseguenza, l’attività antitumorale. In generale, questo studio dimostra che l’acido sialico rappresenta un elemento chiave della multifunzionalità della bLf e sottolinea l’importanza della glicosilazione, in particolare della sialilazione, come parametro essenziale nello sviluppo e nell’applicazione terapeutica di strategie basate sulla Lf.