Approcci di medicina personalizzata tramite strategie di drug repurposing per il trattamento delle encefalopatie epilettiche e dello sviluppo causate da mutazioni nei canali KCNT1 o KCNB1

Ion channels are transmembrane proteins with various functional roles, including the regulation of neuronal excitability: therefore, mutations in these channels can cause disorders of the central nervous system, including Developmental and Epileptic Encephalopathies (DEE), characterized by frequent early-onset seizures, developmental delay, cognitive disabilities, and frequent drugresistance. In particular, KCNT1 and KCNB1 channels play an important pathogenic role in different forms of DEE. In this context, the aim of this Research Project was to characterize the functional effects induced by variants identified in KCNT1 (R356W, R398Q, and R428Q) or KCNB1 (L35P, E180G, I204Tfs*38, R306C, R312C, R312H, V349F, W369*, Y380C, I412T) K+ channels in DEE-affected patients resistant to standard treatments. To this purpose, these variants were engineered into plasmids for heterologous expression via site-directed mutagenesis, and electrophysiology experiments were conducted using the whole-cell patch-clamp technique on CHO cells transiently transfected with plasmids encoding wild-type (WT) or mutant channels, in order to: - define functional effects induced by each variant when compared to WT channels, classifying them as loss-of-function (LoF) or gain-of-function (GoF) variants; - study the pharmacological sensitivity of WT or mutant channels to identify potential new personalized treatments able to restore the channel functionality. To this aim, a drug repurposing strategy was used, which reduces time and costs associated to the design and testing of new drugs and allows early intervention in the treatment of drug-resistant DEE-affected patients. Results showed that all variants found in KCNT1 channels induce GoF effects. Therefore, in order to counteract these effects, the antidepressant drug fluoxetine (FLX), known from the literature as a blocker of several K+ channels, was tested. In fact, FLX (10 µM) was able to block currents expressed by both KCNT1 WT channels (75.0±3.4%; n=12) and those incorporating each variant investigated (93.5±0.6%, 84.7±2.5%, 86.6±1.3% for R356W, R398Q, or R428Q, respectively; n=13-17; p<0.05 vs KCNT1 WT). Based on these results, the drug FLX was added to the therapy of patients carrying these variants, resulting in a significant seizures reduction (>75% for the patient carrying the R398Q variant) and a general improvement in cognition, mood, and behavior. By contrast, almost all variants found in KCNB1 channels showed LoF effects, except for the E180G variant, which showed predominantly GoF effects. In order to counteract these effects, based on data reported in the literature, the antidiabetic drug metformin (MET) was tested as an activator, while FLX and cannabidiol (CBD) were tested as blockers. Exposure to MET (10 µM) on CHO expressing KCNB1 WT or KCNB1 R312H increased currents by 17.4±1.4% (n=15) or 37.8±8.2% (n=4, p<0.05 vs KCNB1 WT), respectively. Conversely, FLX (50 µM) and CBD (10 µM) blocked both, currents expressed by WT (88.2±3.2% or 94.9±1.7%, respectively; n=6-8) and KCNB1 E180G channels (94.6±1.7% or 83.2±2.6, respectively; n=4-5; p<0.05 vs KCNB1 WT for CBD), suggesting that these drugs represent a possible personalized therapy for DEE-affected patients harbouring these variants. In conclusion, the study allowed us to confirm the pathogenicity of the investigated variants and identify alternative treatments with a focus on personalized medicine approaches for patients with drug-resistant DEE.

I canali ionici sono proteine transmembrana con diversi ruoli funzionali, tra cui la regolazione dell’eccitabilità neuronale: pertanto, mutazioni in tali canali possono causare patologie del Sistema Nervoso Centrale, tra cui le Encefalopatie Epilettiche e dello Sviluppo (Developmental and Epileptic Encephalopathies, DEE), caratterizzate da abbondanti crisi epilettiche ad esordio precoce, ritardo dello sviluppo, disabilità cognitive e frequente farmacoresistenza. In particolare, i canali KCNT1 e KCNB1 rivestono un ruolo patogenico importante in diverse forme di DEE. In tale ambito, lo scopo di questo Progetto di Ricerca è stato quello di caratterizzare gli effetti funzionali indotti da varianti identificate nei canali del K+ KCNT1 (R356W, R398Q e R428Q) o KCNB1 (L35P, E180G, I204Tfs*38, R306C, R312C, R312H, V349F, W369*, Y380C, I412T) in pazienti affetti da DEE refrattari ai trattamenti convenzionali. A tale scopo, le varianti sono state ingegnerizzate in plasmidi per espressione eterologa tramite mutagenesi sito-diretta e sono stati condotti esperimenti di elettrofisiologia, tramite tecnica di patch-clamp in configurazione whole-cell, su cellule CHO transientemente trasfettate con i plasmidi codificanti per i canali wild-type (WT) o mutanti, allo scopo di: - definire le conseguenze funzionali indotte da ciascuna variante sul corrispondente canale WT, classificandole così in varianti associate a perdita (o loss-of-function, LoF) o a guadagno (o gain-of-function, GoF) di funzione; - studiare la sensibilità farmacologica dei canali WT o mutanti per identificare potenziali nuovi trattamenti personalizzati capaci di ristabilire la normale funzionalità dei canali. A tale scopo, è stata utilizzata la strategia del drug repurposing, che riduce i tempi e i costi associati a progettazione e sperimentazione di nuovi farmaci e che consente quindi un intervento tempestivo nel trattamento di pazienti affetti da DEE e farmacoresistenti. I risultati mostravano che tutte le varianti riscontrate nei canali KCNT1 inducono effetti GoF. Pertanto, allo scopo di revertire tali effetti, è stato testato l’antidepressivo fluoxetina (FLX), noto dalla letteratura come bloccante di diversi canali del K+. Infatti, FLX (10 μM) è stata in grado di bloccare le correnti espresse sia dai canali KCNT1 WT (75.0±3.4%; n=12) che incorporanti ciascuna variante in studio (93.5±0.6%, 84.7±2.5%, 86.6±1.3% per R356W, R398Q o R428Q, rispettivamente; n=13-17; p<0.05 vs KCNT1 WT). Sulla base di tali risultati, il farmaco FLX è stato aggiunto al trattamento dei pazienti portatori di tali varianti, riscontrando una significativa riduzione delle crisi epilettiche (>75% per il paziente portatore della variante R398Q), un generale miglioramento cognitivo, dell’umore e del comportamento. Al contrario, quasi tutte le varianti riscontrate nei canali KCNB1 hanno mostrato effetti LoF, ad eccezione della variante E180G che ha mostrato effetti prevalentemente GoF. Allo scopo di revertire tali effetti, sulla base dei dati riportati in letteratura, l’antidiabetico metformina (MET) è stato testato come attivatore, mentre FLX e cannabidiolo (CBD) sono stati testati come bloccanti. L’esposizione a MET (10 μM) su CHO esprimenti KCNB1 WT o KCNB1 R312H, aumentava le correnti del 17.4±1.4% (n=15) o 37.8±8.2% (n=4, p<0.05 vs KCNB1 WT), rispettivamente. Al contrario, FLX (50 μM) e CBD (10 μM) bloccavano sia le correnti espresse dai canali WT (88.2±3.2 % o 94.9±1.7%, rispettivamente; n=6-8) che incorporanti la variante E180G (94.6±1.7 % o 83.2±2.6, rispettivamente; n=4-5; p<0.05 vs KCNB1 WT per CBD), suggerendo che tali farmaci rappresentano una possibile terapia personalizzata per i pazienti affetti da DEE portatori di tali varianti. In conclusione, lo studio ha permesso di verificare la patogenicità delle varianti e di individuare farmaci alternativi ai trattamenti standard nell’ottica di una medicina personalizzata per pazienti affetti da DEE e farmacoresistenti.