*Exploration of natural compounds targeting aging-related proteins: approaches for drug discovery

Aging is a multifactorial biological process characterized by progressive physiological decline and an increased risk of chronic diseases, including metabolic disorders, cardiovascular diseases, neurodegeneration, and chronic inflammation. Identifying therapeutic agents able to modulate key molecular pathways involved in aging has become a major focus of contemporary drug discovery. This Ph.D. thesis investigates the therapeutic potential of natural and bioactive compounds as modulators of aging-associated proteins using integrated computer-aided drug discovery (CADD) approaches. The research targets several proteins and signaling pathways implicated in longevity, autophagy, immune regulation, cholesterol metabolism, and cellular energy homeostasis, including Sirtuin 1 (SIRT1), proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9), Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1) with Nrf-2 complex, stimulator of interferon genes (STING), and the NAD⁺ biosynthetic enzymes nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT), and nicotinamide riboside kinase 1 (NRK1). A diverse library of phytochemicals, carotenoids, marine-derived compounds, and other naturally occurring bioactive molecules were systematically evaluated using structure-based computational approaches. A comprehensive in silico workflow including virtual screening, molecular docking, molecular dynamics simulations, binding free energy calculations (MM/GBSA and MM/PBSA), Free Energy Perturbation (FEP), and Density Functional Theory (DFT) analyses was employed to identify and characterize promising lead compounds. The computational analyses revealed several natural compounds with favorable binding affinity, structural stability, and thermodynamic feasibility toward their respective targets. Notably, crocin demonstrated strong interactions with SIRT1, astaxanthin exhibited promising binding to PCSK9, fucoxanthin showed stable inhibition of the Keap1-Nrf2 protein-protein interaction-based inhibitor, Pyrroloquinoline quinone (PQQ) displayed favorable interactions with NAMPT and NRK1, supporting its potential role in NAD⁺ metabolism, and rubiginosin emerged as a promising STING inhibitor with robust binding characteristics validated through advanced free energy calculations. Collectively, the findings provide computational evidence supporting the use of natural compounds as potential modulators of multiple aging-related molecular pathways. This work demonstrates the effectiveness of integrated computational methodologies in accelerating early-stage drug discovery, prioritizing promising lead molecules, and elucidating molecular mechanisms underlying geroprotective activity. The outcomes establish a strong foundation for future experimental validation and contribute to the growing development of multi-target therapeutics for healthy aging and age-associated diseases.

L'invecchiamento è un processo biologico multifattoriale caratterizzato da un progressivo declino fisiologico e da un aumento del rischio di sviluppare malattie croniche, tra cui disturbi metabolici, patologie cardiovascolari, malattie neurodegenerative e infiammazione cronica. L'identificazione di agenti terapeutici in grado di modulare i principali percorsi molecolari coinvolti nell'invecchiamento rappresenta oggi uno degli obiettivi fondamentali della moderna scoperta di farmaci. La presente Tesi di Dottorato indaga il potenziale terapeutico di composti naturali e bioattivi come modulatori di proteine associate all'invecchiamento, mediante un approccio integrato di Computer-Aided Drug Discovery (CADD). La ricerca si è concentrata su diverse proteine e vie di segnalazione coinvolte nella longevità, nell'autofagia, nella regolazione immunitaria, nel metabolismo del colesterolo e nell'omeostasi energetica cellulare, tra cui Sirtuina 1 (SIRT1), proproteina convertase subtilisina/kexin di tipo 9 (PCSK9), Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1) in complesso con Nrf2, stimulatore dei geni dell’interferone (STING) e gli enzimi coinvolti nella biosintesi del NAD⁺, nicotinamide phosphoribosiltransferasi (NAMPT) e nicotinamide ribosil-chinasi 1 (NRK1). Una libreria di fitocomposti, carotenoidi, composti di origine marina e altre molecole bioattive naturali è stata valutata mediante approcci computazionali basati sulla struttura. È stata applicata una strategia di analisi in silico, comprendente virtual screening, molecular docking, simulazioni di dinamica molecolare, calcoli dell'energia libera di legame (MM/GBSA e MM/PBSA), Free Energy Perturbation (FEP) e analisi mediante Density Functional Theory (DFT), al fine di identificare e caratterizzare i più promettenti composti guida. Le analisi computazionali hanno individuato numerosi composti naturali caratterizzati da elevata affinità di legame, stabilità strutturale e fattibilità termodinamica favorevole nei confronti dei rispettivi bersagli molecolari. In particolare, la crocina ha mostrato forti interazioni con SIRT-1, l’astaxantina ha evidenziato un promettente legame con PCSK9, la fucoxantina ha dimostrato una stabile inibizione dell'interazione proteina-proteina Keap1-Nrf2, la pirrolochinolina chinone (PQQ) ha mostrato interazioni favorevoli con NAMPT e NRK1, suggerendo un possibile ruolo nella modulazione del metabolismo del NAD⁺, mentre la rubiginosina è emersa come un promettente inibitore di STING, con caratteristiche di legame confermate mediante avanzati calcoli di energia libera. Nel complesso, i risultati forniscono solide evidenze computazionali a sostegno dell'impiego di composti naturali come potenziali modulatori di molteplici vie molecolari associate all'invecchiamento. Questo lavoro dimostra l'efficacia delle metodologie computazionali integrate nell'accelerare le fasi iniziali della scoperta di farmaci, nella prioritizzazione di promettenti molecole guida e nella comprensione dei meccanismi molecolari alla base dell'attività geroprotettiva. I risultati ottenuti costituiscono una solida base per future validazioni sperimentali e contribuiscono allo sviluppo di strategie terapeutiche multitarget finalizzate alla promozione di un invecchiamento sano e alla prevenzione delle patologie correlate all'età.