Legume landraces biodiversity conservation: morphological, genetic, and metabolomic combined analysis

Agro-biodiversity is a kind of biodiversity, which provides genetic resources relevant to food and agriculture and ecological services that are important for human well-being. However, agro- biodiversity and in particular local varieties are gravely threatened by extinction due to the improper human activities on the environment over the past century, and their replacement by modern genetically uniform varieties. Generally, local varieties are characterized by high genetic variability, specific adaptation to the environmental conditions of the cultivation area (i.e., tolerance to biotic and abiotic stresses), and the presence of secondary metabolites and health-promoting compounds. However, local varieties are often totally neglected and still understudied with a consequent lack of scientific knowledge about their characteristics. To preserve autochthonous landraces, their genetic variability, and their metabolite diversity, as well as to make them an ideal alternative for commercial varieties and to draw the interest of local farmers and consumers involved in their conservation, it is very important to identify their unique characteristics. The aims of this doctoral thesis were: (i) to explore the variability and relationships among different legume landraces through morphological, genetic, and metabolomics analysis; (ii) to identify metabolite biomarkers of landraces, putatively associated to abiotic stress tolerance; (iii) to investigate the biological properties of seed extracts, supporting conservation strategies. Firstly, a recovery activity of local legume varieties was performed in the area of study. The collected autochthonous germplasm was stored ex-situ in Molise Germplasm Bank. A comprehensive characterization activity was performed on the selected lentil and bean landraces. The first study characterized four autochthonous lentil landraces, showing significant morphological, genetic, and metabolomic diversity associated to their local environments. Morphological analysis discriminated against landraces by seed colorimetric traits, while molecular markers showed moderate genetic differences, with geographically proximate varieties displaying higher similarity, probably due to seed exchange practices. Metabolomic profiling by LC-MS/MS detected 662 differentially accumulated metabolic features (DAMfs) among landraces. Antioxidant capacity (RSA%) was different among landraces, with Castelluccio di Norcia exhibiting the highest RSA%, correlated with hydroxycinnamic acid amides and fatty acids. The second study characterized three Italian Phaseolus vulgaris L. landraces—Ciliegino, Fagiolo d’Acqua, and San Michele Rosso— through morphological, genetic, metabolomic, and abiotic stress response analyses. Morphological parameters discriminated against Fagiolo d’Acqua landraces by its seed size and color parameters, while genetic analysis and phaseolin profiles differentiated Ciliegino from the other landraces. NMR metabolomic profiling identified 25 key metabolites, including carbohydrates, organic acids, and amino acids. Ciliegino seed extracts showed significant antiproliferative effects on Caco-2 cells, while Fagiolo d’Acqua extracts promoted cell proliferation. However, San Michele Rosso exhibited a strong tolerance to long-term salt stress with high germination rate. The third study investigated the morphological, genetic, and metabolomic diversity of three Phaseolus vulgaris L. landraces— Ciliegino, San Michele Rosso, and Alubia Roja de Anguiano. Morphological and genetic analyses highlighted distinct traits. San Michele Rosso exhibited unique seed morphology and genetic profile. Metabolomic analysis by LC-MS/MS identified 999 metabolic features, including 344 differentially accumulated metabolites (DAMfs). Biological assays demonstrated the higher antioxidant and antimicrobial activities of San Michele Rosso, correlated with specific flavonoids and peptides. Taken together, these results showed the diversity and unique peculiarities of legume landraces, focusing on their morphological, genetic, and metabolomic traits. The variability of autochthonous germplasm is crucial for increasing resilience and promoting development in marginal rural areas. Using these knowledge, innovative conservation strategies can be implemented involving local farmers in biodiversity conservation, supporting the environmental and economic value of marginal rural areas where these landraces are cultivated.

L'agro-biodiversità è una forma di biodiversità che fornisce risorse genetiche rilevanti per l'alimentazione e l'agricoltura, nonché servizi ecologici essenziali per il benessere umano. Tuttavia, l'agro-biodiversità, e in particolare le varietà locali, è gravemente minacciata di estinzione a causa delle attività umane inappropriate sull'ambiente nel corso dell'ultimo secolo e della loro sostituzione con varietà moderne geneticamente uniformi. In generale, le varietà locali sono caratterizzate da un'elevata variabilità genetica, da un adattamento specifico alle condizioni ambientali dell'area di coltivazione (ad esempio, tolleranza agli stress biotici e abiotici) e dalla presenza di metaboliti secondari e composti benefici per la salute. Tuttavia, le varietà locali sono spesso totalmente trascurate e ancora poco studiate, con una conseguente mancanza di conoscenze scientifiche sulle loro caratteristiche. Per preservare le varietà autoctone, la loro variabilità genetica e la diversità dei metaboliti, nonché per renderle un'alternativa ideale alle varietà commerciali e per attirare l'interesse degli agricoltori e dei consumatori locali coinvolti nella loro conservazione, è molto importante identificarne le caratteristiche uniche. Gli obiettivi di questa tesi di dottorato sono stati: (i) esplorare la variabilità e le relazioni tra diverse varietà locali di legumi attraverso analisi morfologiche, genetiche e metabolomiche; (ii) identificare biomarcatori metabolici delle varietà locali, potenzialmente associati alla tolleranza agli stress abiotici; (iii) investigare le proprietà biologiche degli estratti di semi, supportando strategie di conservazione. In primo luogo, è stata condotta un'attività di recupero delle varietà locali di legumi nell'area di studio. Il germoplasma autoctono raccolto è stato conservato ex-situ nella Banca del Germoplasma del Molise. È stata effettuata una caratterizzazione completa delle varietà locali di lenticchie e fagioli selezionate. Il primo studio ha caratterizzato quattro varietà locali di lenticchie, mostrando una significativa diversità morfologica, genetica e metabolomica associata ai loro ambienti locali. L'analisi morfologica ha discriminato le varietà in base ai tratti colorimetrici dei semi, mentre i marcatori molecolari hanno mostrato differenze genetiche moderate, con varietà geograficamente vicine che presentavano una maggiore somiglianza, probabilmente a causa delle pratiche di scambio di semi. Il profilo metabolomico mediante LC-MS/MS ha rilevato 662 caratteristiche metaboliche differenzialmente accumulate (DAMfs) tra le varietà. La capacità antiossidante (RSA%) è risultata diversa tra le varietà, con Castelluccio di Norcia che ha mostrato il valore più alto di RSA%, correlato con amidi di acidi idrossi-cinnamici e acidi grassi. Il secondo studio ha caratterizzato tre varietà locali italiane di Phaseolus vulgaris L.—Ciliegino, Fagiolo d'Acqua e San Michele Rosso—attraverso analisi morfologiche, genetiche, metabolomiche e di risposta agli stress abiotici. I parametri morfologici hanno discriminato la varietà Fagiolo d'Acqua per le dimensioni e i parametri di colore dei semi, mentre l'analisi genetica e i profili di faseolina hanno differenziato il Ciliegino dalle altre varietà. Il profilo metabolomico mediante NMR ha identificato 25 metaboliti chiave, tra cui carboidrati, acidi organici e aminoacidi. Gli estratti di semi di Ciliegino hanno mostrato significativi effetti antiproliferativi sulle cellule Caco-2, mentre gli estratti di Fagiolo d'Acqua hanno promosso la proliferazione cellulare. Tuttavia, San Michele Rosso ha mostrato una forte tolleranza allo stress salino a lungo termine, con un alto tasso di germinazione. Il terzo studio ha investigato la diversità morfologica, genetica e metabolomica di tre varietà locali di Phaseolus vulgaris L.—Ciliegino, San Michele Rosso e Alubia Roja de Anguiano. Le analisi morfologiche e genetiche hanno evidenziato tratti distintivi. San Michele Rosso ha mostrato una morfologia dei semi e un profilo genetico unici. L'analisi metabolomica mediante LC-MS/MS ha identificato 999 caratteristiche metaboliche, tra cui 344 metaboliti differenzialmente accumulati (DAMfs). I test biologici hanno dimostrato una maggiore attività antiossidante e antimicrobica di San Michele Rosso, correlata a specifici flavonoidi e peptidi. Nel complesso, questi risultati hanno mostrato la diversità e le peculiarità uniche delle varietà locali di legumi, concentrandosi sui loro tratti morfologici, genetici e metabolomici. La variabilità del germoplasma autoctono è cruciale per aumentare la resilienza e promuovere lo sviluppo nelle aree rurali marginali. Utilizzando queste conoscenze, possono essere implementate strategie innovative di conservazione che coinvolgono gli agricoltori locali nella conservazione della biodiversità, sostenendo il valore ambientale ed economico delle aree rurali marginali dove queste varietà locali sono coltivate.