The peculiar processing of LRP8 and its significance for Alzheimer's disease

Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia and at present there are no effective therapies. The cause of the neurodegeneration is unclear and the amyloid cascade hypothesis states that short amyloid β-peptides, derived from the aberrant processing of Amyloid Precursor Protein (or APP) by β- (BACE1) and γ-secretases, are the neurotoxic triggers that cause amyloidosis, neuronal loss, and dementia. Besides the sporadic forms, familial AD is caused by overexpression or mutation into the APP gene, or by mutations into Presenilins genses, which are key components of the enzymatic complex (γ-secretase) that cleaves APP. The scenario is further complicated by the fact that subjects carriers of the Apolipoprotein e4 allele (ApoEe4) may develop AD, anticipating the onset of the disease, being ApoEe4 the major risk factor for AD. Recent literature and the failure of clinical trials to treat amyloid-β peptide, pose at risk the amyloid hypothesis. Further, studies in conditional KO mice for presenilins suggest that a “loss of function” of γ-secretase may more effectively explain a neurodegenerative phenotype. In this scenario, we decided to explore a different hypothesis, starting by the pivotal consideration that APP, presenilins and ApoEe4 are part of a single pathway, still unclear, whose failure leads to neurodegeneration. We therefore focused our studies on the LRP8 receptor, also known as ApoER2, which: 1) interacts with APP, 2) is the receptor for ApoE, and 3) is processed by γ-secretase. Moreover, LRP8, mediating the Reelin signal, takes part in processes such as neuronal migration and dendritic arborization. In our initial studies on LRP8 localization, we determined that in the brain cortex of AD patients, LRP8 levels are reduced at neuronal and parenchymal level and, in parallel, we observed an increment of nuclear staining in Immunohistochemistry experiments. By SDS-PAGE and Western Blot (WB) experiments we evidenced a reduction of LRP8 full-length (~ 100 kDa) protein and a parallel increment of C-terminal fragments (named LICDs), which is more evident in AD patients than in control cases. Thus, our hypothesis is that LRP8 undergoes a different processing in AD, and we speculated that LICDs could translocate into the nucleus with a putative transcriptional function. In this thesis, we explored in vitro the processing and the nuclear localization of LRP8, and its LICDs, in different conditions. To investigate the LRP8 processing we decided to use Neuro 2A (N2A) cells, stably transfected with a plasmid encoding for human LRP8 bearing the ddk-myc tag in the C-terminal extremity, and to recreate in vitro a “loss of function” of γ-secretase, we used DAPT, a specific γ-secretase inhibitor. We initially observed that DAPT-treated cells showed an increase of nuclear LICDs, both in WB and Immunocytochemistry experiments. We therefore explored the involvement of other enzymes, beside γ-secretase, in the formation of LICDs. Using Actinonin, a specific inhibitor of the Meprin β enzyme (known to generate the N-terminus of Aβ peptides, and whose expression is enhanced in AD brain), we determined that Actinonin reduces LICDs formation and nuclear translocation in N2A LRP8-ddk-myc cells. Finally, exploring a putative transcriptional role for LICDs, we determined by RT-PCR that the presence of LICDs into the nucleus is associated with an increment of BACE1’s mRNA level. In conclusion, our data show that LRP8 processing is altered in AD patients, and that, in vitro, this condition is mimicked upon γ-secretase block or “loss of function”. The significance of an increment of LICDs, or rather by the reduction of LRP8 full length receptor, in AD patients and the correlation with ApoEe4 or familial conditions is still to be defined. However, our studies indicate that an increment of LICDs and their nuclear localization may trigger a cyclic pathogenic pathway through an increment of BACE1 levels, enhancing APP processing and amyloid-β formation.

La malattia di Alzheimer (AD) è la forma più comune di demenza e ad oggi non esiste una terapia efficace per guarire. L'ipotesi della cascata amiloide afferma che i peptidi β-amiloidi, derivanti dall’aberrante processing della Proteina Precursore dell’Amilode (o APP) da parte degli enzimi β- (BACE 1) e γ-secretasi, sono responsabili dell’amiloidosi, perdita neuronale e demenza. Oltre alle forme sporadiche, l' AD familiare è causata dalla iperespressione o mutazione nel gene APP, o da mutazioni nei geni delle Preseniline, componenti chiave del complesso enzimatico (γ-secretasi) che scinde APP. Lo scenario è ulteriormente complicato dal fatto che soggetti portatori dell' allele Apolipoproteina e4 (ApoEe4), il principale fattore di rischio dell’AD, possono sviluppare AD, anticipando l'insorgenza della malattia. Il fallimento degli studi clinici per il trattamento dell’amiloide ha messo in dubbio la validità dell' ipotesi della cascata amiloide; d’altro canto, studi su topi KO condizionali per le Preseniline suggeriscono che una perdita di funzione di γ-secretasi spiegherebbe meglio il fenotipo neurodegenerativo. In questo scenario, abbiamo deciso di esplorare un'ipotesi diversa, partendo dalla considerazione che APP, Preseniline e ApoEe4 fanno parte di un unico pathway, ancora poco chiaro, il cui fallimento porta alla neurodegenerazione. Abbiamo quindi focalizzato i nostri studi sul recettore LRP8, noto anche come ApoER2, il quale: 1) interagisce con APP, 2) è il recettore per ApoE e 3) è processato da γ-secretasi. Inoltre LRP8, mediando il segnale della Reelina, è coinvolto in processi come migrazione neuronale e arborizzazione dendritica. Studi preliminari sulla localizzazione di LRP8 hanno evidenziato, attraverso esperimenti di Immunoistochimica, una riduzione sia a livello neuronale che parenchimale dei livelli di LRP8 e un parallelo aumento del segnale nucleare in pazienti con AD. Da esperimenti di SDS-PAGE e Western Blot (WB) abbiamo inoltre riscontrato una riduzione della proteina intera di LRP8 (~ 100 kDa) e un concomitante incremento dei suoi frammenti C-terminali (denominati LICD) nei pazienti con AD rispetto ai casi controllo. Pertanto, la nostra ipotesi è che LRP8 nell’AD subisce un processing diverso e che i frammenti LICD, traslocando nel nucleo, possono avere un ruolo trascrizionale. In questa tesi abbiamo esplorato in vitro il processing e la localizzazione nucleare di LRP8, e degli LICD, in diverse condizioni. Per tale motivo abbiamo utilizzato cellule Neuro 2A (N2A), trasfettate stabilmente con un plasmide codificante per LRP8 umano contenente una coda ddk-myc all' estremità C-terminale; inoltre, per mimare in vitro la "perdita di funzione" di γ-secretasi, abbiamo usato il DAPT, uno specifico inibitore di γ-secretasi. Inizialmente abbiamo osservato, sia attraverso esperimenti di WB che di Immunocitochimica, un aumento nucleare degli LICD nelle cellule trattate col DAPT. Abbiamo quindi esplorato il coinvolgimento di altri enzimi, oltre γ-secretasi, nella formazione degli LICD. Usando l' Actinonina, un inibitore specifico dell' enzima Meprin β (noto per generare peptidi Aβ troncati all’estremità N-terminale, e la cui espressione è aumentata nel cervello di pazientiAD), abbiamo notato che l' Actinonina riduce la formazione degli LICD e la loro traslocazione a livello nucleare. Infine, investigando il presunto ruolo trascrizionale degli LICD, abbiamo determinato mediante RT-PCR che la presenza nucleare degli LICD è associata a un incremento dell’ mRNA di BACE1. In conclusione, i nostri dati evidenziano che il processing di LRP8 è alterato nei pazienti AD e che, in vitro, questa condizione è mimata dal blocco di γ-secretasi. Resta da definire il significato della riduzione di LRP8, e l’ aumento degli LICD, nei pazienti con AD e la correlazione con ApoEe4. Tuttavia, i nostri studi indicano che un incremento degli LICD e la loro localizzazione nucleare possono innescare un meccanismo patogenico, attraverso un incremento dei livelli di BACE 1, un aumento del processing di APP e la formazione dell’ amiloide.