The application of the entomological method to the estimation of minimum PMI (PMIm) requires that all the standards recommended by the best practice be satisfied, from collection of the entomological evidence to identification of species, reconstruction of thermal history and developmental analysis. Aim of this research study is to assess the reliability of the entomological methods for PMI in comparison with estimation and its complex investigative procedure. The research project has been represented by different experimental studies. In the beginning the research project has focused on some critical steps of the collection and storage of entomological samples useful in PMI estimation. In particular: - the effects of boiling of entomological samples and their storage in alcohol solution have been compared to storage of samples in ethanol without boiling. Two forensically important blow flies have been used: Lucilia sericata and Calliphora vicina. The results showed for both species that the estimation of a PMI by larval length is not biased when performed after a time lag of about one week if specimens are stored in ≥ 70% ethanol. Higher concentration such as 96% is better. Different measuring methods of larval length were also tested on C. vicina larvae. No significant differences were detected among the methods demonstrating that a simple tool like a geometrical micrometer can give accurate results for age estimation of larvae useful for the PMI assessment. - the effects of different temporary storing methods of entomological samples before the arrival in the laboratory have been tested. Samples of L. sericata and C. vicina larvae at different stage of development (L1, L2 and L3) were stored without food supply and with and without air for 24h. The results were then compared with a control group in which larvae were reared in boxes with air-permeable lid on their food substrate at 25°C. All boxes were checked for mortality rate (MR) every 24h. Results showed a high MR for L3 larvae (72h after hatching), developed without oxygen up to 100% thus demonstrating how important is oxygen supply during transportation of entomological evidence; - a field study on animal model (pigs) was finally set up. Eight pig cadavers of different body weight were left to decompose under natural conditions. Morphological changes during decomposition were assessed using the total body score (TBS), muscle samples were collected to analyze protein degradation, and insect colonization was daily evaluated. The final goal of the research study is to answer the novel question whether the combined approach of different methods (TBS, skeletal muscle proteins and entomology) could empower the single methods accuracy in PMI estimation. The data obtained showed that the predictive reliability of the methods is greater when used in combination. Individually considered, muscle proteins proved to be extremely useful in the first 5 days of PMI while forensic entomological method in the first 15 days of PMI. The morphological data (TBS) provided important information in cadavers with a delay in the colonization of insects.

Lo scopo del lavoro di tesi è stato quello di valutare l'affidabilità dei metodi entomologici per la stima del PMI, in comparazione con altri approcci investigativi proposti di recente quali: il decadimento delle proteine muscolari unitamente a sistemi di punteggio assegnati alle diverse modificazioni post-mortali. Nella prima parte il progetto di ricerca si è incentrato su alcune fasi critiche dell'indagine entomologica (repertazione, preparazione e conservazione del campione entomologico) per poi proseguire con una indagine in campo aperto con modello animale: • un primo studio ha valutato l’efficacia delle due principali metodiche di repertazione del campione entomologico utilizzato per le stime tanatocronologiche: bollitura degli insetti e loro conservazione in soluzione alcolica vs. conservazione in etanolo senza preventiva bollitura. Tali metodi sono stati testati su due specie di ditteri cadaverici: la Lucilia sericata e la Calliphora vicina. I risultati hanno evidenziato per entrambe le specie che la stima del PMI non è alterata se le misurazioni sono condotte entro una settimana anche in campioni direttamente conservati in etanolo ≥70%, senza preventiva bollitura, privilegiando concentrazioni di etanolo più elevate (es. 96%). Successivamente sono stati confrontati tre diversi metodi di misurazione per la stima della lunghezza larvale di C. vicina. Il confronto tra metodiche ha evidenziato come sia affidabile la misurazione delle larve effettuata mediante un semplice strumento quale un micrometro geometrico; • il secondo studio è stato diretto alla valutazione dei metodi più comuni per la conservazione degli esemplari entomologici nelle 24h che precedono il loro trasferimento in laboratorio. Anche in questo caso, sono state testate due specie di ditteri cadaverici: la L. sericata e la C. vicina. Tutti gli stadi larvali (L1, L2 ed L3) sono stati posti in contenitori privi di un substrato di crescita, con e senza ossigeno per 24h. E’ stato poi esaminato, ogni 24h, il loro grado di sviluppo e il tasso di mortalità (MR). I risultati sono posti a confronto con un gruppo di controllo in cui le larve sono state invece allevate in presenza sia di cibo che di ossigeno ad una temperatura costante di 25°C. L’esito di questo studio ha evidenziato per tutte le larve L3 (72h dopo la schiusa) un alto tasso di mortalità fino al 100%. Questo risultato consente, sulla base di evidenze sperimentali, di raccomandare per la repertazione degli esemplari immaturi di ditteri cadaverici la loro temporanea conservazione, prima del trasferimento in laboratorio, in contenitori aereati al fine di consentire un elevato tasso di sopravvivenza delle larve poi utilizzate nel calcolo del PMI; • un terzo studio è stato caratterizzato da una sperimentazione in “campo aperto” su modello animale. Otto carcasse di maiale di differenti masse corporee sono state lasciate decomporre in condizioni naturali. Durante la decomposizione ogni 24 h sono stati valutati i caratteri di ciascuna modificazione post-mortale mediante l’assegnazione di un punteggio (Total Body Score - TBS) e sono stati raccolti campioni di muscolo scheletrico per l’analisi del decadimento molecolare delle proteine. Contestualmente è stato altresì considerato l’andamento della colonizzazione da parte degli insetti cadaverici. L'obiettivo finale dello studio è stato quello di verificare la potenzialità di un approccio combinato dei diversi metodi (TBS, proteine muscolari scheletriche ed entomologia) nel migliorare l’affidabilità predittiva dei singoli metodi per la stima dell’intervallo post mortale. I dati ottenuti dalla sperimentazione hanno evidenziato come l’affidabilità predittiva delle metodiche utilizzate sia maggiore se utilizzate in associazione. Singolarmente considerate, le proteine muscolari si sono rivelate estremamente utili nei primi 5 giorni di PMI mentre lo studio degli insetti nei primi 15 giorni post-mortem. Il dato morfologico ha fornito importanti informazioni nei cadaveri occultati che presentevano un ritardo nella colonizzazione degli insetti.

Multidisciplinary approach to minimun PMI estimation with a special focus on the entomological evidence

BUGELLI, Valentina
2020

Abstract

Lo scopo del lavoro di tesi è stato quello di valutare l'affidabilità dei metodi entomologici per la stima del PMI, in comparazione con altri approcci investigativi proposti di recente quali: il decadimento delle proteine muscolari unitamente a sistemi di punteggio assegnati alle diverse modificazioni post-mortali. Nella prima parte il progetto di ricerca si è incentrato su alcune fasi critiche dell'indagine entomologica (repertazione, preparazione e conservazione del campione entomologico) per poi proseguire con una indagine in campo aperto con modello animale: • un primo studio ha valutato l’efficacia delle due principali metodiche di repertazione del campione entomologico utilizzato per le stime tanatocronologiche: bollitura degli insetti e loro conservazione in soluzione alcolica vs. conservazione in etanolo senza preventiva bollitura. Tali metodi sono stati testati su due specie di ditteri cadaverici: la Lucilia sericata e la Calliphora vicina. I risultati hanno evidenziato per entrambe le specie che la stima del PMI non è alterata se le misurazioni sono condotte entro una settimana anche in campioni direttamente conservati in etanolo ≥70%, senza preventiva bollitura, privilegiando concentrazioni di etanolo più elevate (es. 96%). Successivamente sono stati confrontati tre diversi metodi di misurazione per la stima della lunghezza larvale di C. vicina. Il confronto tra metodiche ha evidenziato come sia affidabile la misurazione delle larve effettuata mediante un semplice strumento quale un micrometro geometrico; • il secondo studio è stato diretto alla valutazione dei metodi più comuni per la conservazione degli esemplari entomologici nelle 24h che precedono il loro trasferimento in laboratorio. Anche in questo caso, sono state testate due specie di ditteri cadaverici: la L. sericata e la C. vicina. Tutti gli stadi larvali (L1, L2 ed L3) sono stati posti in contenitori privi di un substrato di crescita, con e senza ossigeno per 24h. E’ stato poi esaminato, ogni 24h, il loro grado di sviluppo e il tasso di mortalità (MR). I risultati sono posti a confronto con un gruppo di controllo in cui le larve sono state invece allevate in presenza sia di cibo che di ossigeno ad una temperatura costante di 25°C. L’esito di questo studio ha evidenziato per tutte le larve L3 (72h dopo la schiusa) un alto tasso di mortalità fino al 100%. Questo risultato consente, sulla base di evidenze sperimentali, di raccomandare per la repertazione degli esemplari immaturi di ditteri cadaverici la loro temporanea conservazione, prima del trasferimento in laboratorio, in contenitori aereati al fine di consentire un elevato tasso di sopravvivenza delle larve poi utilizzate nel calcolo del PMI; • un terzo studio è stato caratterizzato da una sperimentazione in “campo aperto” su modello animale. Otto carcasse di maiale di differenti masse corporee sono state lasciate decomporre in condizioni naturali. Durante la decomposizione ogni 24 h sono stati valutati i caratteri di ciascuna modificazione post-mortale mediante l’assegnazione di un punteggio (Total Body Score - TBS) e sono stati raccolti campioni di muscolo scheletrico per l’analisi del decadimento molecolare delle proteine. Contestualmente è stato altresì considerato l’andamento della colonizzazione da parte degli insetti cadaverici. L'obiettivo finale dello studio è stato quello di verificare la potenzialità di un approccio combinato dei diversi metodi (TBS, proteine muscolari scheletriche ed entomologia) nel migliorare l’affidabilità predittiva dei singoli metodi per la stima dell’intervallo post mortale. I dati ottenuti dalla sperimentazione hanno evidenziato come l’affidabilità predittiva delle metodiche utilizzate sia maggiore se utilizzate in associazione. Singolarmente considerate, le proteine muscolari si sono rivelate estremamente utili nei primi 5 giorni di PMI mentre lo studio degli insetti nei primi 15 giorni post-mortem. Il dato morfologico ha fornito importanti informazioni nei cadaveri occultati che presentevano un ritardo nella colonizzazione degli insetti.
The application of the entomological method to the estimation of minimum PMI (PMIm) requires that all the standards recommended by the best practice be satisfied, from collection of the entomological evidence to identification of species, reconstruction of thermal history and developmental analysis. Aim of this research study is to assess the reliability of the entomological methods for PMI in comparison with estimation and its complex investigative procedure. The research project has been represented by different experimental studies. In the beginning the research project has focused on some critical steps of the collection and storage of entomological samples useful in PMI estimation. In particular: - the effects of boiling of entomological samples and their storage in alcohol solution have been compared to storage of samples in ethanol without boiling. Two forensically important blow flies have been used: Lucilia sericata and Calliphora vicina. The results showed for both species that the estimation of a PMI by larval length is not biased when performed after a time lag of about one week if specimens are stored in ≥ 70% ethanol. Higher concentration such as 96% is better. Different measuring methods of larval length were also tested on C. vicina larvae. No significant differences were detected among the methods demonstrating that a simple tool like a geometrical micrometer can give accurate results for age estimation of larvae useful for the PMI assessment. - the effects of different temporary storing methods of entomological samples before the arrival in the laboratory have been tested. Samples of L. sericata and C. vicina larvae at different stage of development (L1, L2 and L3) were stored without food supply and with and without air for 24h. The results were then compared with a control group in which larvae were reared in boxes with air-permeable lid on their food substrate at 25°C. All boxes were checked for mortality rate (MR) every 24h. Results showed a high MR for L3 larvae (72h after hatching), developed without oxygen up to 100% thus demonstrating how important is oxygen supply during transportation of entomological evidence; - a field study on animal model (pigs) was finally set up. Eight pig cadavers of different body weight were left to decompose under natural conditions. Morphological changes during decomposition were assessed using the total body score (TBS), muscle samples were collected to analyze protein degradation, and insect colonization was daily evaluated. The final goal of the research study is to answer the novel question whether the combined approach of different methods (TBS, skeletal muscle proteins and entomology) could empower the single methods accuracy in PMI estimation. The data obtained showed that the predictive reliability of the methods is greater when used in combination. Individually considered, muscle proteins proved to be extremely useful in the first 5 days of PMI while forensic entomological method in the first 15 days of PMI. The morphological data (TBS) provided important information in cadavers with a delay in the colonization of insects.
Forensic entomology; PMI estimation; Forensic pathology; TBS
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11695/100940
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