Analysis of the role of the neuronal receptor LRP8 in the production of exosomes in a cellular model and in the context of Alheimer's disease

An increasing number of evidences has revealed that alterations of endosomal–lysosomal system are connected to alterated sorting and trafficking of different proteins, leading to a significant alteration of protein homeostasis itself. These alterations result particularly compromising in the field of neurodegenerative diseases. In this scenario, exosomes, extracellular vesicles derived from endosomal– lysosomal system, reflecting the alterations present in the cells that produced them, have attracted the attention of the scientific community, as possible early markers of disease. In the field of Alzheimer Disease, exosomes have been shown the capacity to reduce brain Amyloid-beta involving microglial uptake, and negative effects as spreading hyperphosphorylated tau, therefore they could be involved in the mechanisms of apoptosis and, ultimately, contribute to dendritic degeneration. Apolipoprotein E4 expression, the most relevant factor in Late Onset Alzheimer Disease, has a negative impact on exosomes production, both in human brain derived exosomes, and in humanized mouse model expressing ApoE4 allele. One of the target of Apolipoprotein E is Low-density lipoprotein Receptor-related Protein 8 (LRP8 or ApoER2), highly expressed in neuronal tissue and actively involved in memory formation and spines dendridic modeling. Considering that we previously observed that LRP8 localization and processing are alterated in the cerebral cortex of sporadic and familial Alzheimer’s Disease patients, we decided to analyze the role LRP8 on exosomes production. We found that in exosomes derived from brain of patients affected by sporadic and familial Alzheimer (SAD and FAD), C-terminal fragments of the LRP8 receptor with molecular weight less than 15 kDa are strongly present, which instead are not evident in controls; a sign that the proteolytic processing of LRP8 is strongly altered in case of disease and that the contents of the vesicles change radically. The production of exosomes also changes radically, being strongly compromised in the case of FAD. We performed in-vitro experiments using Neuro 2A wild-type cells, stably transfected with human LRP8 (hLRP8) receptor (Neuro 2A DDK myc and Neuro 2A LRP8 HA), and we found that LRP8 receptor expression significantly increases exosomes production. We also expressed in Neuro 2A wild-type cells, the human protein Amyloid Precursor Protein 695 (hAPP 695), and we observed that LRP8 C-terminal fragments are present both in the cell lysates and in the exosomes. We also reported that recombinant human ApoE4 and DAPT (a γ-Secretase inihibitor) treatment, decrease exosomes production in-vitro, and that ApoE4 treatment increase LRP8 C-terminal fragments in exosomes. Finally, to confirm that LRP8 receptor is involved in exosomes production, we performed a silencing on the LRP8 receptor using the Neuro 2A wild- type cells. We observed that silencing the expression of LRP8, there is a significant reduction in the number of exosomes produced.

Un numero crescente di evidenze ha rivelato che alterazioni del sistema endosomiale-lisosomiale sono collegate ad un malfunzionamento nello smistamento di diverse proteine, portando ad una significativa alterazione della stessa omeostasi proteica. Queste alterazioni risultano particolarmente compromettenti nel campo delle malattie neurodegenerative. In questo scenario, gli esosomi, vescicole extracellulari derivate dal sistema endosomiale-lisosomiale, che riflettono le alterazioni presenti nelle cellule che le hanno prodotte, hanno attirato l'attenzione della comunità scientifica, come possibili marcatori precoci di malattia. Nel campo della malattia di Alzheimer, gli esosomi hanno dimostrato la capacità di ridurre la beta-amiloide cerebrale coinvolgendo l'assorbimento microgliale e gli effetti negativi come la diffusione della tau iperfosforilata, quindi potrebbero essere coinvolti nei meccanismi di apoptosi e, in ultima analisi, contribuire alla degenerazione dendritica. L'espressione dell'apolipoproteina E4, il fattore più rilevante nella malattia di Alzheimer ad esordio tardivo, ha un impatto negativo sulla produzione di esosomi, sia negli esosomi derivati dal cervello umano, sia nel modello murino umanizzato che esprime l'allele ApoE4. Uno dei bersagli dell'apolipoproteina E è la proteina 8 correlata al recettore delle lipoproteine a bassa densità (LRP8 o ApoER2), altamente espressa nel tessuto neuronale e attivamente coinvolta nella formazione della memoria e nella modellazione dei dendriti. Considerando che in precedenza abbiamo osservato che la localizzazione e l'elaborazione di LRP8 sono alterate nella corteccia cerebrale di pazienti affetti da Alzheimer sporadico e familiare, abbiamo deciso di analizzare il ruolo dell'LRP8 sulla produzione di esosomi. Abbiamo riscontrato che negli esosomi derivati dal cervello di pazienti affetti da Alzheimer sporadico e familiare (SAD e FAD), sono fortemente presenti frammenti C-terminali del recettore LRP8 con peso molecolare inferiore a 15 kDa, che invece non sono evidenti nei controlli; segno che il processo proteolitico di LRP8 è fortemente alterato in caso di malattia e che il contenuto delle vescicole cambia radicalmente. Anche la produzione di esosomi cambia radicalmente, essendo fortemente compromessa nel caso di FAD. Abbiamo eseguito esperimenti in vitro utilizzando cellule wild-type Neuro 2A, trasfettate stabilmente con il recettore umano LRP8 (hLRP8) (Neuro 2A DDK myc e Neuro 2A LRP8 HA) e abbiamo scoperto che l'espressione del recettore LRP8 aumenta significativamente la produzione di esosomi. Abbiamo anche espresso nelle cellule Neuro 2A wild-type, la proteina umana Amyloid Precursor Protein 695 (hAPP 695), e abbiamo osservato che i frammenti C-terminali LRP8 sono presenti sia nei lisati cellulari che negli esosomi. Abbiamo evidenziato che il trattamento con ApoE4 umano ricombinante e DAPT (un inibitore della γ-secretasi) diminuisce la produzione di esosomi in vitro e che il trattamento con ApoE4 aumenta i frammenti C-terminali di LRP8 negli esosomi. Infine, per confermare che il recettore LRP8 è coinvolto nella produzione di esosomi, abbiamo eseguito un silenziamento sul recettore LRP8 utilizzando le cellule wild-type Neuro 2A. Abbiamo osservato che silenziando l'espressione di LRP8, c'è una significativa riduzione del numero di esosomi prodotti.