Cryobanking of poultry, rabbit and native Mediterranean trout semen as tool for genetic resources safeguard and new perspectives for a proteomic approach in semen cryobiology

Both domestic and wild native animal species represent a genetic biodiversity heritage of inestimable value all over the world. Their valuable intrinsic properties contribute to support economic prosperity and human well-being, despite the deep changes that are “globally” and “locally” taking place. Knowing, valorizing and conserving these precious genetic resources is a social, cultural, scientific and economic imperative that is the key to adaptation and survival in a human dominated environment. Italy appears to be one of the richest countries in animal biodiversity within the European Union. Because of the presence of extremely different environments, it has the highest number and density of animal species characterized by a high rate of endemism. However, the combined effect of harmful anthropic actions and the introduction of modern intensive production methods, associated to increasing income, human population and urbanization, has led to a dramatic increase in the number of endangered native species, resulting in an irreversible loss of genetic resources. In this scenario, Italian biodiversity of local poultry and rabbit breeds, as well as native Mediterranean trout populations, is currently in an alarming decline. As result, over the last two decades, these valuable genetic resources becoming the focus of important national conservation programs, exclusively aimed at the maintenance of live populations. According to the Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), the in situ conservation strategy is in fact considered a priority for the safeguard of endangered populations. However, this approach, is often too expensive, and the achievement of genetic goals is going on at a relatively slow pace. Therefore, the ex situ in vitro strategy, as integrated support to the in situ strategy, is getting more and more attention. In particular, the use of artificial insemination (AI) with cryopreserved semen has been recognized as the most widespread method for ensuring the long-term conservation of genetic diversity, through the establishment of semen cryobanks. In this context, the urgent need to establish national actions aimed at promoting ex situ conservation programs, has recently favored the financing of three important projects, one of which is an European project: 1) Recovery of S. macrostigma: Application of innovative techniques and participatory governance tools in the rivers of Molise - (Life Nat.Sal.Mo); and two national projects 2) Tutela della Biodiversità nelle razze Avicole Italiane – TuBAvI (MiPAAF); 3) La Cunicoltura del Futuro: benessere e sostenibilità degli allevamenti cunicoli italiani - Cun-Fu (MiPAAF). These projects have a common aim, which is to preserve and valorize the local poultry and rabbit breeds (TuBAvI and Cun-Fu projects), and native Mediterranean trout populations (Nat.Sal.Mo project), through the combined use of in situ and ex situ conservation strategies. Accordingly, milestones of the present projects are the creation of semen cryobanks for the safeguard of these precious Italian heritage. In this regard, systematic studies of the main factors affecting the cryopreservation procedures of turkey, rabbit and Mediterranean trout semen have become necessary, in order to reduce cell damages caused by freezing/thawing process. In the light of this, the present doctoral thesis is an integral part of the three more extended projects mentioned above. The research activities were focused on developing effective reference procedures in order to ensure the long-term conservation of this valuable Italian genetic diversity. In accordance with these goals, a comparative proteomic study on fresh and frozen rabbit semen was also performed in order to provide new knowledge concerning the main mechanisms involved in cryogenic sperm damage in this species. The results of these studies are presented in the form of six published manuscripts and one draft article divided into four sessions, as follows: • session 1 includes three studies designed to optimize and identify a reference procedure for semen freezing of native Mediterranean trout and the results obtained from the start-up of the semen cryobank for this species; • session 2 includes two studies aimed to identify and standardize a reference procedure for freezing turkey semen through the evaluation sensitivity to freezing in vitro and the fertilizing ability in vivo. Moreover, the activities performed for the implementation of the first Italian avian semen cryobank were also reported in detail; • session 3 includes one study designed to develop a reference procedure for rabbit semen cryopreservation by comparing two extenders and three different inseminating doses, followed by the results achieved from the creation of the first national semen cryobank for Italian rabbit breeds; • session 4 includes one draft article aimed to evaluate, for the first time, the changes in rabbit semen proteins induced by cryopreservation process, trought comparative analysis of the differential expression of proteins in fresh and frozen semen.

Le specie animali, sia domestiche che selvatiche, rappresentano un patrimonio di biodiversità genetica di inestimabile valore in tutto il mondo. Le loro caratteristiche intrinseche contribuiscono a sostenere la prosperità economica e il benessere umano, nonostante i profondi cambiamenti in atto a livello globale e locale. Conoscere, valorizzare e conservare queste preziose risorse genetiche è un dovere sociale, culturale, scientifico ed economico e rappresenta la chiave dell’adattamento e della sopravvivenza in un ambiente dominato dall’uomo. L’Italia, essendo caratterizzata da una grande varietà di paesaggi ambientali e climi estremamente diversi, è considerata uno dei paesi europei più ricchi di biodiversità animale con il maggior numero di endemismi. Tuttavia, l’effetto combinato di azioni antropiche dannose e l’introduzione dei moderni sistemi di produzione intensiva, associati all’aumento del reddito, della popolazione umana e all’urbanizzazione, hanno portato ad un aumento drammatico del numero di specie autoctone in via di estinzione, guidando il paese verso un irreversibile perdita di risorse genetiche. In questo scenario, il numero di razze avicole e cunicole italiane, così come le naturali popolazioni autoctone di Trota Mediterranea, sono attualmente in allarmante declino. Pertanto, negli ultimi due decenni, queste preziose risorse genetiche sono diventate il fulcro di importanti programmi di conservazione, finalizzati esclusivamente al mantenimento delle popolazioni in situ. Secondo l’Organizzazione delle Nazioni Unite per l’alimentazione e l’agricoltura (FAO), questa strategia di conservazione è considerata prioritaria per la salvaguardia delle popolazioni a rischio di estinzione. Tuttavia, a causa della complessità del mantenimento degli animali vivi, questo tipo di approccio risulta spesso troppo costoso ed il raggiungimento degli obiettivi genetici procede ad un ritmo relativamente lento. Di conseguenza, la strategia di conservazione ex situ in vitro sta ottenendo sempre più maggiore attenzione nell’ambito della gestione e conservazione delle risorse genetiche animali, come supporto integrato alla strategia in situ. In particolare, la possibilità di utilizzare il seme congelato nella pratica dell’inseminazione artificiale (AI), rappresenta un fattore chiave per assicurare la conservazione a lungo termine della diversità genetica, attraverso l’istituzione di una criobanca del seme. In questo contesto, l’urgente bisogno di istituire azioni nazionali volte a supportare l’attuazione di programmi di conservazione ex situ in vitro, ha recentemente promosso il finanziamento di tre progetti, di cui uno europeo 1) “Recovery of S. macrostigma: Application of innovative techniques and participatory governance tools in the rivers of Molise” (Life Nat.Sal.Mo); e due italiani 2) “Tutela della Biodiversità nelle razze Avicole Italiane” (TuBAvI); 3) “La Cunicoltura del Futuro: benessere e sostenibilità degli allevamenti cunicoli italiani” (Cun-Fu). I presenti progetti, sono caratterizzati da uno scopo comune, ossia quello di preservare e valorizzare le razze avicole e cunicole italiane (TuBAvI e Cun-Fu) e le popolazioni native di Trota Mediterranea (Life Nat.Sal.Mo), attraverso l’uso combinato di strategie di conservazione in situ ed ex situ. Pertanto, nell’ambito di questi progetti, la creazione delle prime criobanche del seme italiane finalizzate alla salvaguardia di questo prezioso patrimonio di biodiversità animale, ha rappresentato un importante pietra miliare. A tal riguardo, sono divenuti necessari studi sistematici dei principali fattori in grado di influenzare il successo delle procedure di crioconservazione del seme di tacchino, coniglio e Trota Mediterranea, al fine di ridurre il danno cellulare provocato dal processo di congelamento/scongelamento. Alla luce di questa premessa, le attività di ricerca incluse nella presente tesi di dottorato sono parte integrante dei tre progetti più estesi sopramenzionati, il cui scopo è stato quello di sviluppare efficaci procedure di riferimento per la crioconservazione del seme di queste preziose risorse genetiche italiane, al fine di garantirne la conservazione a lungo termine. Inoltre, in linea con il raggiungimento dei presenti obiettivi, è stato effettuato anche uno studio di proteomica comparativa che ha avuto come scopo quello di confrontare i pattern proteici del seme di coniglio fresco e crioconservato. La logica di questa ricerca è stata quella di svelare, per la prima volta, i principali meccanismi coinvolti nel danno criogenico del seme nella specie cunicola. I risultati di questi studi sono presentati sotto forma di sei manoscritti pubblicati e una bozza di articolo, opportunamente ripartiti in quattro sessioni come segue: • la sessione 1 include tre studi finalizzati ad ottimizzare e identificare una procedura di riferimento per la crioconservazione del seme di Trota Mediterranea, ed i risultati ottenuti dall’avvio della prima criobanca del seme per questa specie; • la sessione 2 include due studi il cui scopo è stato quello di identificare e standardizzare una procedura di riferimento per il congelamento del seme di tacchino, attraverso la valutazione della sensibilità al congelamento in vitro e della capacità fertilizzante in vivo. Inoltre, sono riportate nel dettaglio le attività svolte ed i risultati ottenuti dalla creazione della prima criobanca italiana del seme di razze avicole autoctone; • la sessione 3 include uno studio il cui obiettivo è stato quello di sviluppare una procedura di riferimento per la crioconservazione del seme di coniglio, attraverso la comparazione di due diluenti e tre differenti dosi di inseminazione. Inoltre, sono riportati i risultati ottenuti dall’avvio della prima criobanca italiana del seme di razze cunicole autoctone; • la sessione 4 include i risultati sperimentali ottenuti dalla prima analisi comparativa del profilo proteico del seme di coniglio fresco e congelato, finalizzato a valutare i principali meccanismi fisiologici e biochimici influenzati dalla procedura di criocoservazione del seme nella specie cunicola.