Campylobacter rappresenta il principale agente zoonotico causa di malattie a trasmissione alimentare a livello europeo. Pertanto, al fine di sviluppare nuove strategie di prevenzione è necessario avere a disposizione di metodologie innovative per la sua rapida identificazione e quantificazione negli alimenti. I metodi di analisi di riferimento per la determinazione e quantificazione di questo patogeno richiedono più di 48 ore per definire la presenza/numerazione del microrganismo. L’obiettivo generale del lavoro è stato quello di sviluppare metodi quali-quantitativi, basati rispettivamente sull'uso della Real-Time PCR (q-PCR) e della Droplet Digital PCR (ddPCR), al fine di avere a disposizione dei sistemi rapidi e specifici per valutare la reale prevalenza del patogeno nella filiera alimentare. Utilizzando il gene 16S rRNA come regione target per i primer e le sonde come sistema di rilevazione, è stata sviluppata una qPCR con un Controllo Interno di Amplificazione non competitivo. La selettività del metodo è stata valutata analizzando 26 differenti ceppi Campylobacter e 40 ceppi non-Campylobacter. Per verificare l’applicabilità della piattaforma sono stati sperimentalmente contaminati 5 campioni di carne suina; ciascun campione è stato diviso in tre aliquote: un’aliquota è stata utilizzata come controllo negativo, le altre due sono state inculate con 10 e 102 UFC/ml di Campylobacter (C.) jejuni. Le aliquote, dopo la fase di incubazione, sono state sottoposte all’analisi mediante qPCR, previa estrazione del DNA batterico, mediante Chelex 100. Il metodo qualitativo sviluppato, è stato poi implementato per realizzare una piattaforma di ddPCR al fine di effettuare una quantificazione assoluta del DNA del patogeno. L’ottimizzazione è stata effettuata analizzando soluzioni scalari (106 – 10 ufc/ml) di un ceppo di riferimento di C. jejuni. Al fine di valutare l’applicabilità delle metodiche sviluppate, 54 prodotti tipici di origine animale sono stati analizzati mediante qPCR, ddPCR ed i metodi microbiologici di riferimento. I risultati relativi alla selettività di entrambi i metodi hanno evidenziato il 100% di inclusività e di esclusività in quanto i ceppi di Campylobacter analizzati sono stati amplificati ed i ceppi non-Campylobacter sono risultati negativi. I risultati ottenuti dall’analisi con qPCR dei campioni di suino, sperimentalmente contaminati, hanno mostrato una concordanza del 100% rispetto ai risultati ottenuti con il metodo di riferimento. L’analisi mediante ddPCR ha evidenziato un livello minimo di rilevabilità di 10 UFC/ml e l’impossibilità di quantificare livelli di concentrazione superiori a 105 UFC/ml, a causa della eccessiva saturazione delle droplet. Infine, l’analisi dei campioni reali ha evidenziato l’assenza del patogeno e la concordanza delle metodiche sviluppate con i metodi di riferimento. In conclusione, le piattaforme molecolari sviluppate rappresentano dei modelli che, dopo accurata validazione, qualora adottati, sia nell’ambito del controllo ufficiale che nei piani di autocontrollo, consentirebbero di implementare la sicurezza lungo la filiera alimentare.
Nuovi approcci analitici per la determinazione e quantificazione di Campylobacter in prodotti tipici di origine animale
S. Santonicola;
2019-01-01
Abstract
Campylobacter rappresenta il principale agente zoonotico causa di malattie a trasmissione alimentare a livello europeo. Pertanto, al fine di sviluppare nuove strategie di prevenzione è necessario avere a disposizione di metodologie innovative per la sua rapida identificazione e quantificazione negli alimenti. I metodi di analisi di riferimento per la determinazione e quantificazione di questo patogeno richiedono più di 48 ore per definire la presenza/numerazione del microrganismo. L’obiettivo generale del lavoro è stato quello di sviluppare metodi quali-quantitativi, basati rispettivamente sull'uso della Real-Time PCR (q-PCR) e della Droplet Digital PCR (ddPCR), al fine di avere a disposizione dei sistemi rapidi e specifici per valutare la reale prevalenza del patogeno nella filiera alimentare. Utilizzando il gene 16S rRNA come regione target per i primer e le sonde come sistema di rilevazione, è stata sviluppata una qPCR con un Controllo Interno di Amplificazione non competitivo. La selettività del metodo è stata valutata analizzando 26 differenti ceppi Campylobacter e 40 ceppi non-Campylobacter. Per verificare l’applicabilità della piattaforma sono stati sperimentalmente contaminati 5 campioni di carne suina; ciascun campione è stato diviso in tre aliquote: un’aliquota è stata utilizzata come controllo negativo, le altre due sono state inculate con 10 e 102 UFC/ml di Campylobacter (C.) jejuni. Le aliquote, dopo la fase di incubazione, sono state sottoposte all’analisi mediante qPCR, previa estrazione del DNA batterico, mediante Chelex 100. Il metodo qualitativo sviluppato, è stato poi implementato per realizzare una piattaforma di ddPCR al fine di effettuare una quantificazione assoluta del DNA del patogeno. L’ottimizzazione è stata effettuata analizzando soluzioni scalari (106 – 10 ufc/ml) di un ceppo di riferimento di C. jejuni. Al fine di valutare l’applicabilità delle metodiche sviluppate, 54 prodotti tipici di origine animale sono stati analizzati mediante qPCR, ddPCR ed i metodi microbiologici di riferimento. I risultati relativi alla selettività di entrambi i metodi hanno evidenziato il 100% di inclusività e di esclusività in quanto i ceppi di Campylobacter analizzati sono stati amplificati ed i ceppi non-Campylobacter sono risultati negativi. I risultati ottenuti dall’analisi con qPCR dei campioni di suino, sperimentalmente contaminati, hanno mostrato una concordanza del 100% rispetto ai risultati ottenuti con il metodo di riferimento. L’analisi mediante ddPCR ha evidenziato un livello minimo di rilevabilità di 10 UFC/ml e l’impossibilità di quantificare livelli di concentrazione superiori a 105 UFC/ml, a causa della eccessiva saturazione delle droplet. Infine, l’analisi dei campioni reali ha evidenziato l’assenza del patogeno e la concordanza delle metodiche sviluppate con i metodi di riferimento. In conclusione, le piattaforme molecolari sviluppate rappresentano dei modelli che, dopo accurata validazione, qualora adottati, sia nell’ambito del controllo ufficiale che nei piani di autocontrollo, consentirebbero di implementare la sicurezza lungo la filiera alimentare.I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
