Semen cryopreservation as a tool for preserving genetic biodiversity of avian and rabbit species: national cryobank launch

The possibility of using semen in frozen form for artificial insemination (AI) practice, is a key factor for ensuring the long-term conservation of genetic diversity through the creation of a semen cryobank. The present doctoral thesis is part of a more extended project realized by some Italian universities including the University of Molise, aiming to preserve and valorize Italian poultry and rabbit breeds by many actions including even the construction of a national semen cryobank. In this regard, the main aim is the identification of reference procedures for the cryopreservation of poultry (turkey and chicken) and rabbit semen according to the “FAO guidelines”. The results of these studies are presented in the form of published manuscripts for turkey (study 1) and chicken (study 2) whilst for rabbit (study 3), the results have been resubmitted after revision process for publication. The study 1 (http://dx.doi.org/10.1080/00071668.2016.1148261) was designed to identify a suitable protocol for freezing turkey semen in straws exposed to nitrogen vapour by examining the effects of two different concentrations of DMA (8 or 18% respectively) in comparison with two different concentrations of DMSO (4 or 10% respectively) as cryoprotectant (CPA), using three different freezing rates (1, 5, and 10 cm from nitrogen vapour) and two different thawing rates (4 or 50°C) on in vitro post-thaw semen quality. The variables assessed after thawing were sperm motility, viability and osmotic resistance. Marked effects were shown by the cryoprotectant concentration, freezing rate and thawing temperature with best results obtained using DMA 18% or DMSO 10% using a freezing rate of 10 cm and a thawing rate of 50°C. The study 2 (https://doi.org/10.1111/rda.13070) aimed to compare effect of four different permeating cryoprotectants and two thawing temperatures (37 vs. 5°C) on sperm post-thaw motility and to analyse combined effect of the best permeating cryoprotectant (P-CPA) with one of four non-permeating cryoprotectants (N-CPA) on post-thaw quality of rooster semen evaluated in vitro. Pooled semen from Ross PM3 rooster heavy line was diluted in Kobidil+ extender and frozen in cryoprotectant solution containing 6% dimethylacetamide (DMA), 7.5% dimethylformamide (DMF), 9% N-methylacetamide (MA) or 8% ethylene glycol (EG) in liquid nitrogen vapours. To determine the best thawing rate, straws were thawed either at 37 or 5 °C. Once identified EG as the best permeating CPA, the latter, was associated to different N-CPAs using either 0.75 mol/L ficoll, 0.2 mol/L sucrose, 0.2 mol/L trehalose or 0.05 mol/L glycine. Sperm motility, membrane destabilization, viability, morphology and ultrastructure were analysed to compare different freezing–thawing conditions. Our results indicated that the combination of EG and the thawing at 5°C improved (p ≤ 0.05) sperm post-thaw motility. Moreover, ficoll addition to EG-based freezing extender, provided additional beneficial effect (p ≤ 0.05) on progressive movement and apoptosis incidence. The study 3 (in press), aimed to investigate in vitro and in vivo the effect of the initial cooling time at 5°C during semen cryopreservation procedure. Pooled semen samples (n=6) were divided into two subsamples and cooled at 5°C for 45 or 90 min. After the cooling step, the semen samples were diluted with a freezing extender composed of Tris-citrate-glucose (TCG) containing 16% of dimethylsulfoxide (DMSO) and 0.1 M sucrose and frozen in liquid nitrogen vapour. After thawing, sperm motility, viability, osmotic resistance, acrosome and DNA integrity were assessed. Our in vitro and in vivo results indicate that the 90 min cooling incubation prior to dilution with cryoprotectants improves the post-thaw quality of rabbit semen when compared to 45 min.

La possibilità di utilizzare il seme congelato per la pratica di inseminazione artificiale (IA) è un fattore chiave per assicurare la conservazione a lungo termine della diversità genetica assicurando la creazione di criobanche del seme. La presente tesi di dottorato, fa parte di un progetto più esteso realizzato da alcune università italiane tra cui l’Università del Molise con l’obiettivo di preservare e valorizzare le razze italiane di tacchino, pollo e coniglio attraverso un gran numero di azioni volte a costruire una criobanca nazionale del seme. A questo riguardo essa mira all’identificazione delle procedure di riferimento per la crioconservazione di seme di pollo e tacchino e di seme di coniglio secondo le linee guida della FAO. I risultati degli studi riguardanti il seme di tacchino (studio 1), e di pollo (studio 2), sono stati presentati sottoforma di manoscritto pubblicato, mentre quelli riguardanti lo studio condotto sul seme di coniglio (studio 3) sono stati risottomessi dopo processo di revisione ai fini della pubblicazione. Lo studio 1 (http://dx.doi.org/10.1080/00071668.2016.1148261) è stato progettato per identificare un protocollo idoneo per il congelamento del seme di tacchino mediante straw esposte a vapori di azoto liquido esaminando gli effetti di due differenti concentrazioni di DMA (8 o 18 % rispettivamente) in confronto con due differenti concentrazioni di DMSO (4 o 10 % rispettivamente) come crioprotettore (CPA) usando tre differenti tassi di congelamento (1, 5 e 10 cm di distanza dai vapori di azoto liquido) e due differenti tassi di scongelamento (4 o 50°C ) sulla qualità post-scongelamento del seme in vitro. Le variabili testate dopo lo scongelamento sono state la motilità spermatica, la vitalità e la resistenza osmotica. Effetti marcati su queste variabili sono stati indotti dalla concentrazione di crioprotettori, dal tasso di congelamento e dalla temperatura di scongelamento. I migliori risultati sono stati ottenuti utilizzando DMA 18% o DMSO 10% utilizzando un tasso di congelamento di 10 cm e un tasso di scongelamento di 50°C. Lo studio 2 (https://doi.org/10.1111/rda.13070) ha avuto come obiettivo quello di confrontare l’effetto di 4 differenti crioprotettori permeabili e due temperature di scongelamento (37 °C contro 5 °C) sulla motilità post-scongelamento del seme di gallo e analizzare l’effetto combinato del migliore crioprotettore permeabile (P-CPA) con uno dei quattro crioprotettori non permeabili (N-CPA) sulla qualità post-scongelamento valutata in vitro.   I pool di seme ottenuti dal gallo di linea pesante Ross PM3, sono stati diluiti in diluente Kobidil+ e congelati in una soluzione crioprotettiva contenente 6% di DMA, o 7,5% di dimetilformamide (DMF), o 9% N-metilacetamide (MA) o 8% di etilenglicole (EG), mediante esposizione ai vapori di azoto liquido. Al fine di determinare il migliore tasso di scongelamento, le straw sono state scongelate a 37 °C o a 5 °C. Una volta identificato l’EG come migliore crioprotettore permeabile, quest’ ultimo è stato associato a differenti crioprotettori non permeabili, utilizzando 0.75 mol/L di ficoll, 0.2 mol/L di saccarosio, 0.2 mol/L di trealosio oppure 0.05 mol/L di glicina. La motilità spermatica, la destabilizzazione della membrana spermatica, la vitalità, la morfologia e l’ultrastruttura sono state analizzate per confrontare differenti condizioni di congelamento-scongelamento. I nostri risultati hanno indicato che la combinazione di EG e lo scongelamento a 5 °C hanno migliorato la motilità post congelamento del seme. Inoltre l’aggiunta del ficoll al diluente a base di EG ha avuto un effetto benefico sul movimento progressivo e sull’incidenza di apoptosi. Lo studio 3 (in press), ha avuto come scopo principale quello di studiare l’effetto in vitro ed in vivo, del tempo iniziale di raffreddamento (45 o 90 minuti) a 5 °C durante la procedura di crioconservazione. I pool di seme (n=6) sono stati divisi in due sub-campioni e raffreddati a 5 °C secondo ciascun trattamento. Dopo la fase di raffreddamento, il seme è stato diluito con un diluente specifico composto da Tris-citrato-glucosio, 0.1 M di saccarosio e il 16% di DMSO. Il seme impacchettato nelle straw è stato congelato in azoto liquido. Dopo il congelamento, sono state valutate la motilità spermatica, la vitalità, la resistenza osmotica, l’integrità dell’acrosoma e del DNA. I nostri risultati in vitro ed in vivo, indicano che il raffreddamento per 90 min prima dell’aggiunta dei crioprotettori, ha migliorato la qualità spermatica post-scongelamento del seme di coniglio rispetto al raffreddamento di 45 min.