Identification of novel pathogenetic mechanisms, genotype-phenotype correlations and pharmacological approaches in early-onset epilepsies

The co-assembling of Kv7.2 (kcnq2) and Kv7.3 (kcnq3) subunits forms tetrameric channel underlying K+ current (called M-current) which regulates neuronal excitability. Each subunit is formed by six transmembrane segments (S1-S6) and cytoplasmic N- and C-termini; the pore domain is encompassed by the S5-S6 segments and the intervening linker of each subunit, whereas S1-S4 segments form the voltage-sensing domain (VSD). Although mutations in kcnq2 have been first associated to a benign form of epilepsy called Benign Familial Neonatal Seizures (BFNS), more recently de novo mutations in this gene have been found in patients affected by Early-Onset Epileptic Encephalopathy (EOEE), a severe clinical condition characterized by abnormal EEG, pharmacoresistant seizures and psychomotor retardation. In the present work, we have characterized the biochemical, functional and pharmacological properties, together with the neuronal subcellular distribution of EOEE-causing Kv7.2 mutations localized in the VSD (S187F, S195P, R201C), in the pore (G256R, A265T) or in the C-terminus domain (R325G, R553G). To this aim, mutations were engineered in plasmids encoding for untagged Kv7.2 subunits and expressed in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells to characterize their biochemical and functional consequences on Kv7.2 subunits. In parallel, the same mutations were also engineered in plasmids encoding tagged Kv7.2 subunits (EGFP-Kv7.2-HA) and expressed in rat hippocampal neurons to study by immunocytochemistry the possible mutation-induced alterations in neuronal trafficking. Patch-clamp recordings revealed that all mutations produced functional alterations of Kv7.2 currents: in particular, mutations localized in the VSD produced an alteration in the voltage sensitivity of Kv7.2 by mechanisms ranging from loss-of-function (S187F) to gain-of-function (S195P, R201C); multistate structural modeling and disulfide trapping experiments revealed that the R210C mutations destabilized the resting state of the channel, thereby producing gain-of-function effects. By contrast, the mutations localized in the pore (G256R or A265T) or at C-terminus (R325G, R553G) induced a dramatic reduction in the maximal current, although western-blotting experiments revealed normal total and plasma membrane subunit expression. When loss-of-function mutant subunits were expressed in heteromeric configurations with Kv7.2/Kv7.3 channels, a significant reduction in maximal current densities were measured when compared to Kv7.2/Kv7.3 wild-type channels; however, these functional deficits were rescued by application of the activator retigabine, suggesting a potential role in clinical treatment in patient carrying these kcnq2-variants. When expressed in neurons, EGFP-Kv7.2-HA subunits were clearly detected by anti-HA antibodies in non permeabilized neurons mainly at the AIS; this subcellular localization was still observed for EGFP-Kv7.2-HA subunits carrying mutations in the VSD or in the C-terminus domain, whereas no signal was detected in neurons expressing EGFP-Kv7.2-HA subunits carrying pore mutations. Altogether, these results suggest that distinct pathogenetic mechanisms are associated to each Kv7.2 variant and that they appear to be dependent on the location where the mutation falls: the VSD and C-terminus mutations mainly induce functional alterations while mutations in the pore both suppress channel function and alter the subunit traffic to the AIS, suggesting a novel pathogenetic mechanism.

Le subunità Kv7.2 (kcnq2) e Kv7.3 (kcnq3) formano un canale tetramerico che sottende una corrente del K+ coinvolta nella regolazione dell’eccitabilità neuronale. Ciascuna subunità è costituita da 6 segmenti transmembrana (S1-S6) e da una lunga coda intracellulare al C-terminale: i segmenti da S1 a S4 formano il dominio del sensore del voltaggio (VSD), mentre i segmenti S5-S6 ed il loop di connessione formano la regione poro. Mutazioni nel gene kcnq2 sono state inizialmente associate a Convulsioni Benigne Familiari Neonatali e più recentemente anche ad Encefalopatia Epilettica a insorgenza precoce (EOEE), una severa condizione clinica caratterizzata da alterazioni nell’EEG, convulsioni farmacoresistenti e ritardi nello sviluppo neurocognitivo. Nel presente lavoro, sono state caratterizzate le conseguenze biochimico-funzionali e farmacologiche, nonchè la distribuzione neuronale subcellulare di subunità Kv7.2 incorporanti mutazioni riscontrate in pazienti affetti da EOEE e localizzate nel VSD (S187F, S195P, R201C), nel poro (G256R, A265T) o nel C-terminale (R325G, R553G) del canale Kv7.2. A tale scopo, le mutazioni sono state riprodotte sia nel cDNA codificante per la subunità Kv7.2 non taggata, per la caratterizzazione biochimico-funzionale in cellule di ovaio di criceto cinese, sia nel cDNA codificante per subunità Kv7.2 taggate (EGFP-Kv7.2-HA) per lo studio della distribuzione subcellulare in neuroni ippocampali. Le registrazioni elettrofisiologiche hanno rivelato che tutte le mutazioni in studio producono alterazioni funzionali delle correnti Kv7.2: in particolare, le mutazioni localizzate nel VSD producono un’alterazione della sensibilità al voltaggio, sia in termini di riduzione (S187F) che di aumento (S195P, R201C); esperimenti di modeling e di elettrofisiologia accoppiata a mutagenesi hanno dimostrato che l’effetto di guadagno di funzione riscontrato per la mutazione R201C è dovuto al ruolo cruciale del residuo R201 nella stabilizzazione dello stato di riposo del sensore. Al contrario, le mutazioni localizzate nella regione del poro (G256R, A265T) o nel dominio C-terminale (R325G, R553G) inducono una drammatica riduzione nella densità di corrente nella forma omomerica del canale, sebbene esperimenti di western-blotting mostrino che le subunità Kv7.2 incorporanti le mutazioni sono normalmente espresse sia nella quota totale sia a livello della membrana. Tale riduzione nella densità di corrente perdurava anche quando tali subunità sono state co-espresse in una configurazione eteromerica con le subunità Kv7.2/Kv7.3. L’applicazione di retigabina, noto attivatore dei canali Kv7, era in grado di ripristinare tali deficit funzionali. Quando espressa in neuroni, la subunità EGFP-Kv7.2-HA era rilevabile a livello del segmento iniziale dell’assone in neuroni non permeabilizzati; tale distribuzione subcellulare non era alterata per le subunità EGFP-Kv7.2-HA incorporanti le mutazioni nel VSD o nel C-terminale, mentre nessun segnale era rilevabile in neuroni esprimenti la subunità EGFP-Kv7.2-HA incorporanti le mutazioni nel poro. Nel complesso, questi risultati suggeriscono che distinti meccanismi patogenetici sono associati a ciascuna mutazione e che essi sembrano dipendere dalla localizzazione della mutazione nel canale Kv7.2: le mutazioni nel VSD e nel C-terminale alterano la funzionalità del canale mentre le mutazioni nel poro sopprimono sia la funzione del canale Kv7.2 sia la localizzazione a livello dell’AIS.