Biochemical approaches to study protein-ligand interaction for pharmacological applications

Questo lavoro ha riguardato l’utilizzo di comuni tecniche biochimiche ottimizzate per lo studio delle interazioni proteina-ligando coinvolte in alcune patologie di frequente incidenza, quali il morbo di Alzheimer ed il cancro. Il morbo di Alzheimer è una patologia neurodegenerativa, progressiva ed irreversibile, caratterizzata principalmente da un’alterazione del sistema colinergico, con conseguente riduzione dei livelli del neurotrasmettitore acetilcolina (Ach), e dall’accumulo extracellulare di placche senili costituite soprattutto dal peptide β-amiloide (Aβ). Allo stato attuale delle conoscenze mediche non c’è ancora una cura definitiva per questa malattia; il trattamento si avvale di terapie farmacologiche di tipo sintomatico e palliativo, il cui scopo è quello di inibire sia le colinesterasi, onde ripristinare i livelli naturali dell’Ach, sia la β-secretasi 1 (BACE-1), per prevenire l'aggregazione del peptide Aβ. A tal fine, composti analoghi del Donepezil, farmaco attualmente utilizzato per le forme lieve e moderata del morbo di Alzheimer, sono stati identificati, mediante procedure di “docking” molecolare, e quindi sintetizzati, mediante procedure di sintesi “eco-friendly”. Per tutte le molecole sintetizzate, strutturalmente più rigide del Donepezil e caratterizzate da gruppi sostituenti differenti, è stato valutato i) l’effetto sull’attività dell’AChE, ii) la selettività nei confronti di BuChE, iii) l’effetto inibitorio sull’attività enzimatica di BACE-1 e iv) la tossicità su linee cellulari di neuroblastoma. Da questi esperimenti è risultato che tra tutti i composti sintetizzati solo due possono essere dei promettenti candidati per lo sviluppo di nuovi farmaci per il trattamento dell’Alzheimer, essendo caratterizzati da una duplice attività inibitoria, sia nei confronti di AChE che di BACE-1. La proteina p53 regola il ciclo cellulare e svolge la funzione di soppressore tumorale. La sua attività è regolata dalle proteine Minute Double Mourine (MDM) 2 e 4, meglio conosciute come MDM2 e MDMX, le quali agiscono nei confronti di p53 attraverso un meccanismo di tipo feedback negativo, legandosi al dominio idrofobico N-terminale della proteina. In effetti, un’interessante strategia per la terapia del cancro sarebbe ripristinare la funzionalità di p53 antagonizzando l’attività regolatrice negativa di MDM2/X. A tal fine, è stata ottimizzata la comune tecnica dell’elettroforesi in condizioni native, per lo studio dei complessi che l’oncosoppressore p53 forma con MDM2/MDMX. Tale tecnica sfrutta la differente mobilità elettroforetica delle proteine su gel di poliacrilammide in condizioni non denaturanti. Il vantaggio di utilizzare l’elettroforesi in condizioni native consiste nell’economicità e nella semplicità della metodica, a differenza dei metodi attualmente utilizzati per lo stesso tipo di analisi, quali ad esempio la tecnica NMR, la risonanza plasmonica di superficie o la fluorescenza polarizzata. Dagli esperimenti condotti, tale tecnica è risultata potenzialmente utile anche per uno screening delle molecole dotate di un potenziale potere farmacologico antitumorale.